一种快速有效检测SSR标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶的银染方法

郭培国， 刘文杰， 李海洋， 王直亮， 夏岩石， 李荣华

(广州大学 生命科学学院, 广东 广州　510006)



一种快速有效检测SSR标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶的银染方法

郭培国， 刘文杰， 李海洋， 王直亮， 夏岩石， 李荣华

(广州大学 生命科学学院, 广东 广州510006)

聚丙烯酰胺凝胶银染法是一种具有高分辨率检测SSR标记的有效方法，然而传统的银染方法存在操作步骤较多、所需时间较长及试剂种类与用量较多等不足.本研究利用菜心和烟草SSR标记为研究对象，建立一种能快速有效检测其PCR扩增产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶的银染方法.该方法包括染色和显影2个主要操作步骤，整个银染流程耗时6～7 min，只需要AgNO3、NaOH和甲醛3种试剂，所检测SSR标记的DNA条带清晰、易辨.与其他银染法相比，本研究建立的银染法具有易于操作、耗时少、所需试剂种类和用量少及检测效果好的优势.

SSR标记； 检测； 非变性聚丙烯酰胺凝胶； 银染

DNA简单序列重复(SSR)标记在植物基因组中覆盖面广、数量丰富，且具有特异性强、共显性和操作简单的优点[1]，已成为研究工作者常用的分子标记之一.该技术已广泛应用于植物的遗传多样性分析、生物进化、遗传图谱的构建、QTL定位和分子标记辅助育种等研究和应用工作[2-3].

聚丙烯酰胺凝胶的银染法是检测SSR标记的常用方法之一，该方法具有较高的灵敏度和较高的分辨率，可鉴别出低至1 pg·mm-2的DNA量和区分1个碱基的差异[4-5].但传统经典的银染法操作流程含有固定、漂洗、银染、漂洗、显色和终止等步骤，在使用前需配制一些溶液等[5]，存在操作复杂、耗时和费力等不足；另外，其染色的一致性、银染后凝胶的贮存时间等方面亦不是很理想[6-7].针对银染操作繁琐及染色效果的不足，先后有一些研究对银染方法进行了改进，如修改了固定步骤中固定液的成分、减少了显色和终止步骤要求10 ℃低温的条件[8-9]；取消固定步骤、调整染色液和显色液化学成分及比例等[6, 10-16].但这些改良的银染方法在操作繁琐程度或效率上仍存在不足，在化学试剂种类及用量上面还有减少的空间.

据此，本研究在前人建立的银染方法基础上，利用菜心(BrassicacampestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee)和烟草(NicotianatabacumL.)SSR标记作研究对象，探讨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染检测方法，建立一种仅需染色和显色2个主要步骤、3种试剂的操作简单、耗时少和分辨力高的快速有效检测SSR标记的银染方法，适用于大量SSR标记的基因分型工作.

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料

供试的菜心材料为“四九-19号菜心”、“油绿501”、“3T6”和“柳叶50”，由广州市农业科学院提供；烟草材料“红花大金元”、“粤烟98”、“118-3”和“岩烟97”，由广东省烟草南雄科学研究所提供；盆栽种植供试的菜心和烟草材料.

1.1.2SSR标记的引物和试剂

选取菜心和烟草SSR标记的引物组合各1对，用于检测银染的效果.这些SSR标记的引物由生物工程生工(上海)股份有限公司合成，其信息见表1.DNA分子大小标样DL500购自于日本宝生物工程株式会社(Takara Bio Inc.)，其他试剂均购自于Sigma-Aldrich公司.

表1菜心和烟草SSR标记引物信息

Table 1The information of SSR primers of flowering Chinese cabbage and tobacco

植物材料SSR标记名称正向引物序列5'-3'反向引物序列5'-3'菜心CX-3ACTCGAATTCCGGTGAGTTGCATTGCACCTGCTCATGTTT烟草TME0580TGGAAACGTTTGCTTAAGGGTAGTGCAACGTGGACATTTGAA

1.2方法

1.2.1DNA的提取

采收幼嫩的菜心和烟草材料的叶片，按李荣华等[17]改良的CTAB法提取菜心和烟草材料的基因组DNA；采用琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量，用NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo Scientific，USA)检测DNA的浓度，并将之调整到10 ng·μL-1作为SSR扩增的DNA模板.

1.2.2PCR扩增及电泳分离

在10 μL的PCR反应总体积中，含10 ng·μL-1的DNA模板2.0 μL，10×PCR Buffer 1.0 μL，25 mmol·L-1MgCl20.8 μL，10 μmol·L-1正向引物0.25 μL，10 μmol·L-1反向引物0.25 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.25 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.15 μL，ddH2O 5.3 μL.PCR扩增循环反应程序：94 ℃预变性5 min，之后按94 ℃下变性45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min的PCR程序运行35个循环，最后再在72 ℃条件下延伸10 min；之后置于4 ℃条件下贮藏备用.

选取美国CBS公司MGV-216-33双面三倍宽垂直电泳槽及电泳仪，电泳玻璃板大小为33 cm宽×16 cm高，采用6%(丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺之比为29∶1)的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离SSR标记的PCR扩增产物.凝胶厚度为1.5 mm，每个载样孔宽3 mm，上样2 μL.电泳条件为电压120 V，电泳时间120 min.

1.2.3银染方法

电泳结束后，取下附有凝胶的玻璃板，按表2中列出的各个银染方法的实验条件和步骤进行操作，除有说明外，均在室温下操作.银染结束待凝胶晾干后，用BenQ M800扫描仪扫描，贮存扫描图片.在电脑中观察、读取数据并分析.

表2　不同DNA银染方法操作步骤

2　结果与分析

2.1不同银染方法的检测效果

图1为除去颜色并调整至适宜亮度和对比度后不同银染法检测菜心和烟草SSR标记的银染图.从图1可见，所有的银染方法均能检测到烟草和菜心SSR标记的主条带，但BASSAM等[5]、QU等[10]和KUMAR等[16]3种银染法的背景反差较小，DNA条带强度低和清晰度不高，一些具有多态性的次级条带难观察到，检测效果差.SANGUINETTI等[8]和BYUN等[13]银染法的条带强度和清晰度要高于前3种方法，主条带清晰易辨，且能粗略判断次级条带的多态性，但清晰度不高.而AN等[14]、LIANG等[15]和本研究建立的银染法效果更进一步，经扫描成像后的凝胶背景较浅、清晰度高，菜心和烟草SSR标记的主、次条带强度高且清晰，容易检测；尤其是本研究建立的改良银染法，检测效果最佳.

图1　不同聚丙烯酰胺凝胶银染法检测菜心和烟草SSR标记的结果

A～H分别为BASSAM等[5]、SANGUINETTI等[8]、QU等[10]、BYUN等[13]、AN等[14]、LIANG等[15]、KUMAR等[16]和本研究建立的银染法.图中M为DNA分子大小标样，1～4分别为烟草品种“岩烟97”、“ 红花大金元”、“ 118-3”和“粤烟98”的SSR标记TME0580的扩增产物，5～8分别为菜心品种“油绿501”、“柳叶50”、“四九-19号菜心”和“3T6”的SSR标记CX-3的扩增产物.

2.2不同银染方法所需时间和试剂种类分析

根据各个银染方法报道的从固定或染色步骤开始至完全显色或终止步骤的操作流程，测定各银染法检测菜心和烟草SSR标记PCR扩增产物所耗费的时间.几种银染方法实际所需检测时间见表3.从表3可见，BASSAM等[5]、SANGUINETTI等[8]和KUMAR等[16]建立的银染方法所需的时间较长，检测需时在30 min以上；QU等[10]和BYUN等[13]建立的银染方法需要15 min或以上，而AN等[14]和LIANG等[15]建立的银染法减少了银染所需的时间，但仍分别需时10 min；而本研究建立的银染法只需6～7 min，整个银染过程所需时间最短.

从银染所需试剂的种类来看，BASSAM等[5]、SANGUINETTI等[8]和BYUN等[13]的方法需5种试剂，QU等[10]、AN等[14]、LIANG等[15]和KUMAR等[16]银染法需6种试剂，而本研究建立的改良银染法仅需3种试剂(表3)，这3种试剂为AgNO3、NaOH和甲醛，且用量亦相对较少(表2).

表3几种银染方法检测菜心和烟草SSR标记所需时间和试剂种类的比较

Table 3Comparison of time and types of reagents for detecting SSRs of flowering Chinese cabbage and tobacco by different silver staining methods

项目BASSAM等[5]方法SANGUINETTI等[8]方法QU等[10]方法BYUN等[13]方法AN等[14]方法LIANG等[15]方法KUMAR等[16]方法本研究建立的银染法检测时间/min723016151010426～7试剂种类数55656663

3　讨　论

目前SSR标记主要采用琼脂糖凝胶电泳检测和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的方法，其中琼脂糖凝胶电泳技术由于易于操作而被广泛使用，但存在难以分辨几个碱基差异的不足；聚丙烯酰胺凝胶电泳可区分几个碱基的差异，但BASSAM等[5]和SANGUINETTI等[8]建立的传统银染法检测聚丙烯酰胺凝胶中SSR扩增产物，具有操作步骤较多(包括固定、清洗、染色、清洗、显色、终止和清洗等步骤)、耗时较长等不足；使用荧光SSR标记技术能提高检测效率[18]，但需要较为昂贵的专用仪器设备，检测所需的试剂药品花费也较高，普通实验室里难以开展检测工作.据此，不少研究对银染法进行了改进，如在染色步骤中加入5%～10%乙醇，将原银染法中的固定、清洗和染色步骤合并成一个同时进行固定和染色的步骤[6, 10, 13-16, 19]，或不加乙醇直接进入染色步骤[11]；将银染检测过程减少至2个[6, 15]或3～4个主要步骤[10-11, 13-14, 16]，但有些银染法流程的操作较为复杂，如需在5 ℃[16]或55 ℃条件下显色[13].报道这些改进方法银染操作时间最少可达13～15 min[11, 16],有的最低可至10 min左右[6, 10, 13-14],甚至达7 min[15].但利用业已报道的银染法的操作步骤检测本研究菜心和烟草SSR标记时发现，需时最少的为AN等[14]和LIANG等[15]建立的银染法，均为10 min，但高于其报道所需的7～9 min的检测时间，这一现象亦在其他银染法[5, 10, 13, 16]中出现.究其原因，是各方法中显色步骤所需时间均高于其报道所需的最少时间(数据未发表)，因而导致整个检测过程所需时间的增加.而本研究建立的银染法，只有染色和显色2个主要步骤，检测菜心和烟草SSR标记只需要6～7 min；从检测SSR标记所需时间来看，优于其他银染法.

从菜心和烟草SSR标记的检测效果来看，BASSAM等[5]、QU等[10]和KUMAR等[16]建立的银染方法背景较浅、显淡黑色，DNA条带强度较弱，尽管能分辨出SSR标记的主条带，但次级条带相对较模糊，辨别难度较大，表明这些方法的分辨力较低.SANGUINETTI等[8]、AN等[14]、BYUN等[13]、LIANG等[15]及本研究建立的改良银染法染色背景呈浅黄色，SSR标记的DNA条带强度高，经扫描除黄色背景色、调整亮度和对比度后，凝胶图背景浅、SSR标记的主、次级条带较清晰，易于辨别，均可有效检测菜心和烟草的SSR标记.其中AN等[14]、LIANG等[15]及本研究建立的改良银染法DNA条带强度高、对比度大、分辨力高，检测效果好,尤为本研究建立的改良银染法，DNA条带更为清晰易辨.

另外，本研究建立的改良银染法检测菜心和烟草SSR标记时所需试剂种类和用量最少，与检测效果较好、耗时较短的AN等[14]和LIANG等[15]所需6种试剂相比，未使用这2种方法需要的乙醇、HNO3、Na2CO3或铬黑T(EBT)，只利用这2种方法均具有的AgNO3、NaOH和甲醛3种试剂.AgNO3和NaOH的用量与An等[14]方法基本一致，但分别为LIANG等[15]方法的75%和25%；而甲醛的含量则为这2种方法的25%.这一结果表明，染色步骤中溶液的乙醇和HNO3成分不影响DNA的检测效果，但较高浓度的HNO3可能延长显色步骤中DNA显色所需的时间.究其原因是染色液中具有的HNO3，染色结束后1次5～10 s的去离子水冲洗难以将HNO3清洗完全，残留在凝胶中的HNO3减缓显色步骤中碱性环境下甲醛与Ag+的反应速度，从而延长显色时间.

4　结　论

本研究建立一种能快速、有效检测SSR标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染方法，检测效果明显优于传统的银染方法.该银染法只需染色和显色2个主要步骤，整个银染过程耗时6～7 min，检测只需AgNO3、NaOH和甲醛3种试剂且用量少.具有简便快速、成本低、检测效果好和对环境污染少的特点，适合于大量样品的SSR标记的基因分型工作.

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【责任编辑： 陈钢】

A rapid and effective method of silver staining for detecting SSR markers in nondenaturing polyacrylamide gels

GUO Pei-guo, LIU Wen-jie, LI Hai-yang, WANG Zhi-liang, XIA Yan-shi, LI Rong-hua

(School of Life Sciences, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China)

Silver staining is an effective method to detect SSRs with high resolution in polyacrylamide gel. However the conventional methods of silver staining are time-consuming because they have a number of time-dependent procedures with more kinds of reagents. Here we reported a rapid and effective silver staining method for detecting PCR amplification products in nondenaturing polyacrylamide gel by using SSRs of flowering Chinese cabbage and tobacco. This method includs two major steps——staining and development,within 6 to 7 mins, and requirs only three reagents which are HNO3, NaOH and HCOH. With the method, DNA fragments of SSRs are unambiguously detected with high resolution. Compared with other silver staining methods, this new method has advantages of easy operation, time-saving, less amount of chemical reagents and good detection effect.

SSR marker; detection; nondenaturing polyacrylamide gel; silver staining

2016-06-03;

2016-06-09

国家自然科学基金资助项目(30871526);广东省自然科学基金资助项目(2015A030310136, 2015A030313500)；广东省科技计划资助项目(2016B020201001)；广东省烟草专卖局科技计划资助项目(201201, 201403)；广东省普通高校国际暨港澳台合作创新平台及国际合作重大资助项目(2015KGJHZ015)；广州市科技计划资助项目(2014J4100123)；广州市属高校科技计划资助项目(1201420621)

郭培国(1963-),男，教授，博士．E-mail: guopg@gzhu.edu.cn; guopg@yahoo.com

1671- 4229(2016)04-0008-05

Q 503

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