低强度压力感受器刺激治疗心房颤动的实验研究

屈园园 江洪

[摘要] 目的 探讨低强度颈动脉窦压力感受器电刺激（LL-CBS）对9小时快速心房起搏（9hRAP）所致的心房颤动（AF）的影响。 方法 14只比格犬（7～9 kg）麻醉后分为对照组（6只）和LL-CBS组（8只）。将多电极导管缝合于心房和肺静脉。所有动物均接受9hRAP，LL-CBS组的动物在行9hRAP同时给予持续的LL-CBS，将80%阈电压的电刺激定义为LL-CBS。9hRAP后测所有位点的有效不应期（ERP）、ERP离散度及AF诱发窗口（WOV）。实验末留取心房组织采用RT-PCR分析缝隙连接蛋白43（Cx43）的表达情况。 结果 与对照组比较，LL-CBS组所有位点的ERP延长，Cx43的DNA含量增加，ERP离散度和AF诱导性降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 LL-CBS可抑制AF发生，这种保护机制与调控心房Cx43的表达有关。

[关键词] 低强度压力感受器刺激；心房颤动；缝隙连接蛋白43

[中图分类号] R541.7+5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（c）-0026-04

Experiment study of treatment on atrial fibrillation with low-level carotid baroreceptor stimulation

QU Yuanyuan JIANG Hong▲

Department of Cardiology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To test the hypotheses that low-level carotid baroreceptor stimulation （LL-CBS） protects against atrial fibrillation （AF） induced by 9 hours rapid atrial pacing （9hRAP）. Methods Fourteen anesthetized beagles （7-9 kg） were divided into two groups： control group（6 cases） and LL-CBS group （8 cases）. Multi-electrode catheters were attached to the atria and pulmonary vein. All animals received 9hRAP， and animals in LL-CBS group received continuous LL-CBS at the same time， a voltage of stimulation setting at 80% below the threshold was defined as LL-CBS. The atrial effective refractory period （ERP）， ERP dispersion and the window of vulnerability （WOV） for AF were measured at all recording sites after 9hRAP. DNA of Atrial tissue was reserved at the end of the protocol and expression of Cx43 was determined by real time polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results Compared with control group， in LL-CBS group， ERP in all sites lengthened， DNA of Cx43 increased， ERP dispersion and AF inducibility decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion LL-CBS can suppress AF， the protective effects of LL-CBS may be due to its regulation of atrial Cx43 expression.

[Key words] Low-level carotid baroreceptor stimulation； Atrial fibrillation； Connexin 43

心房顫动（AF）是最常见的快速性心律失常[1]。AF的发病率和死亡率日渐升高，成为当今社会一项严重危害健康的疾病[2]。自主神经在AF的发生和维持中发挥重要作用[3]。调节自主神经功能可能有助于控制AF的发生[4]。目前普遍认为降低交感活性，增加迷走张力，有抗房性心律失常作用[5]。

低强度电刺激颈动脉窦压力感受器（LL-CBS）可以提高AF的诱发阈值[6]。心房细胞膜上的缝隙连接主要由连接蛋白（Cx）构成，其中以Cx43为主。该蛋白表达或分布异常在AF发生中发挥重要作用。多项研究发现，AF动物和AF患者心房Cx43表达下降[7]。本研究将采用经典的AF模型来探索LL-CBS对AF的调控是否与Cx43相关。

1 材料与方法

1.1 动物准备

所有实验动物均由武汉大学人民医院动物中心提供。14只健康成年比格犬（体重7～9 kg，合格证号：No.4200020000021），戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉。气管插管接呼吸机（MAO01746，Harvard，美国），室内空气持续正压通气，设定潮气量500 mL/min，呼吸频率20次/min。分离一侧股动静脉，并建立动静脉通道，股动脉连接压力换能器监测血压。实验过程中，静脉输生理盐水（50～100 mL/h）以补充手术创口及鞘管流失的液体。每小时股静脉追加戊巴比妥钠2 mg/kg。为维持正常体温，于犬下方放置一电热板，维持体内温度在（37.0±0.5）℃。皮下针刺电极持续监测体表心电图、心率。经第四肋间隙行双侧开胸术，剪开心包，将多电极导管缝于左右心房及肺静脉处，包括左心房（LA），左心耳（LAA），左上肺静脉（LSPV），左下肺静脉（LIPV），右心房（RA），右心耳（RAA），右上肺静脉（RSPV），右下肺静脉（RIPV）。电极另一端连接神经活性记录仪。所有电生理信号与血压信号均接入多导联生理记录仪（2000B，四川锦江）。

1.2 LL-CBS和实验分组

颈右侧作纵向切口，暴露颈总动脉和颈内动脉的分叉处并与周围组织分离。将一枚特制的Ag-AgCl刺激电极缠绕于颈动脉窦外壁，电极另一端连与脉冲发生装置（SEN-7013，Nihon Kohden，东京，日本）。进行3～4次电刺激，每次持续3～5 min，若每次电刺激均能引起血压和心率明显降低，证实电极缠绕在正确部位。停止电刺激15 min后，血压和心率通常可恢复至刺激前水平，则进行下一次刺激。将能使血压降低10%的电压视为阈值。选择80%的阈电压进行LL-CBS，每隔30 min进行阈电压校正。脉冲转换器按以下参数设定：2.4～4.8 V，50 Hz，0.5 ms脉宽。

14只犬分为对照组（n=6）和LL-CBS组（n=8）。对照组行9小时快速心房起搏（9hRAP），LL-CBS组在快速起搏同时进行CBS。

1.3建造AF模型

行9hRAP：按照Yu等[8]的实验方法，左侧第四肋间隙开胸暴露心脏后，将一刺激电极缝于左心耳处，刺激电极尾线连接Grass刺激仪（Grass-S88，Astro-Med，West Warwich RI），测定起搏阈值，以2倍起搏阈值的强度进行快速心房起搏，起搏的频率为20 Hz（1200 次/min），脉宽为0.1 ms，时间为9 h。在每小时末，重新测定起搏阈值以保证始终以2倍起搏阈值的强度起搏。

1.4 檢测电生理指标

对缝制的8个位点分别进行测量。采用S1S2法测定有效不应期（ERP），先给予8个周期恒定的基数刺激（S1-S1 = 330 ms）后，给予一个期前刺激S2，S1-S2间期由150 ms开始，每次缩短10 ms，若遇到不应期，每减少1 ms。刺激电压选用10倍刺激阈值。记录到所有位点的变异系数即为ERP离散度，即标准差与均数之商。将诱发窗口（WOV）用于定量测量AF的诱发性。测量ERP时，在数次诱发出的AF中，最长和最短的S1-S2间期即为WOV。ΣWOV是所有位点WOV之和。ΣWOV越大，AF越容易诱发。分别在刺激前及9hRAP后测得上述各指标。

1.5 Cx43定量分析

从左右心房多位点获取心房组织，提取细胞RNA并用DNA酶处理，用凝胶电泳对样品进行定性和定量分析[9]。Cx43 RNA双向引物由上海泛亚生物技术公司提供。Cx43上游引物：5'-AGA AAG AGG AGG AGC TCA AAG TTG-3，下游引物：5'-TTC AAT CTG CTT CAA GTG CAT GT-3'。用实时定量PCR检测系统（Biosystems）检测荧光信号。该实验采用优化的PCR方案：PCR初期将混合物置于95℃温浴2 min，使之变性，随后进行40次PCR循环，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s。按2-ΔΔCT计算mRNA的相对表达量[10]，将甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参。

1.6 统计学方法

采用统计软件SPSS 18.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 右侧LL-CBS对ERP的影响

在基础状态，两组各部位ERP差异无统计学意义（P > 0.05）（表1）。实验9 h后，LL-CBS组动物心房8个位点ERP值与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）（表2）。

2.2 右侧LL-CBS对ERP离散度的影响

在基础状态，两组ERP离散度[（0.04±0.02）比（0.05±0.03）ms]，差异无统计学意义（P > 0.05）。对LL-CBS组动物进行起搏及电刺激后，9 h末ERP离散度为（0.06±0.03）ms，对照组在进行9hRAP后，ERP离散度为（0.16±0.05）ms，对照组显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

与对照组比较，*P < 0.05；LL-CBS：低强度电刺激颈动脉窦压力感受器

图1 9小时快速心房起搏后两组有效不应期离散度

2.3 右侧LL-CBS对ΣWOV的影响

在基础状态，两组ΣWOV间[（25±6）比（22±8）ms]差异无统计学意义（P > 0.05）。对照组行9hRAP后，ΣWOV为（163±40）ms，对LL-CBS组动物进行起搏及电刺激后，9 h末ΣWOV为（42±5）ms，LL-CBS组显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05），AF诱导性降低。见图2。

与对照组比较，*P < 0.05；LL-CBS：低强度电刺激颈动脉窦压力感受器；WOV：诱发窗口

图2 9小时快速心房起搏后两组ΣWOV

2.4 右侧LL-CBS对Cx4基因表达的影响

与对照组比较，LL-CBS组Cx43相对mRNA水平显著增高（0.13±0.05比0.25±0.04），差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

本实验主要提出，LL-CBS阻止心房细胞Cx43丢失，从而降低AF诱导性。右侧LL-CBS延长心房ERP，降低AF诱导性，同时维持Cx43在正常表达水平，稳定了心房电生理活动。

压力感受器位于心脏和各大血管中，可以同时调节交感张力和迷走张力[11]。颈动脉压力反射主要产自于颈动脉窦中的压力感受器，该感受器可探测局部血压[12]。颈动脉压力反射通过调节交感张力，在调控血压中发挥重要作用。在针对难治性高血压患者亚组的研究中发现，颈动脉窦压力感受器刺激（CBS）使交感活动受到抑制，并能增加迷走神经活性，从而抑制全身交感神经[13]。CBS已被用于治疗难治性高血压和慢性心衰[14-15]，其机制可能是调控自主神经活动。而自主神经功能失调是AF发生的潜在机制，因此笔者推测，CBS可能具有抗AF的作用。本实验设定使血压降低10%的刺激为阈刺激，80%的阈刺激即为LL-CBS。而在本研究中发现，LL-CBS可以在RAP的AF模型中抑制心房电重构和AF的发生，从而证实了这一推测。CBS将信号传至背部脊髓，在腹外侧脊髓发生信号的转换和处理，并传出至心脏[13]。高强度的CBS显著增加AF诱导性[16]，而低强度的CBS可抑制AF的诱发[12]。

心房缝隙连接蛋白主要为Cx43。Cx43的表达和分布发生改变可严重影响电偶联和电刺激的传播。电传导紊乱使得AF易于发生。连接蛋白表达降低，心房电传递速度减慢，促进微小电折返的发生，这是持续性AF发生的关键因素[17]。已有学者进行相关基因研究，连接蛋白基因突变或基因删除，连接蛋白表达低于正常水平，心房肌傳导速度减慢，AF易诱发[18]。另有实验，在AF实验动物上进行Cx43基因转移，该措施显著加快心房传递速度，有效终止了AF发作[19]。本研究中，LL-CBS可抑制急性犬实验中RAP诱导的AF，延长心房ERP并保护心房细胞Cx43。LL-CBS抑制Cx丢失可能与多种机制相关：首先，Cx43是一种短寿蛋白，在心脏中其半衰期仅数小时[20]，LL-CBS可能抑制Cx降解从而延长其半衰期。其次，已有研究报道，NO经cGNP抑制PDE3活性，抑制Cx基因的表达[21]。LL-CBS可能通过激活NO合成酶，增加NO释放，使得Cx表达上调。第三，只有磷酸化的Cx才具有活性[22]，LL-CBS能激活蛋白激酶引起Cx发生磷酸化。

本研究LL-CBS组中，LL-CBS能显著抑制9hRAP引起的ERP缩短、ERP离散度延长和ΣWOV增加，证实LL-CBS能有效抑制心房急性电重构，与Liao等[6]的研究一致。但本实验只研究了LL-CBS的短期效应（9 h），其长期效应有待建立慢性AF模型进一步研究。已有研究表明，LL-CBS通过抑制心脏神经节丛（GP）活性，降低AF诱导性[6]。本实验中，LL-CBS抑制心房细胞膜Cx43丢失与GP活性降低关系如何，低强度电刺激左侧颈动脉压力感受器是否产生同样功效，还有待深入研究。

刺激自主神经系统可引起心房电生理发生显著变化，并能诱发AF，本研究认为神经调节是控制AF的一项有效手段，且部分神经干预措施已用于临床使用[3]。LL-CBS可抑制AF发生，对血压无明显影响。对于CBS与AF关系的深入研究，有助于CBS在临床运用中的推广。

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（收稿日期：2015-10-30 本文編辑：苏 畅）