石斛合剂对2型糖尿病大鼠肝脏蛋白表达的影响

秦崇涛，张捷平，刘如玉，吴世代，施红

(福建中医药大学中西医结合学院，福州350122)



石斛合剂对2型糖尿病大鼠肝脏蛋白表达的影响

秦崇涛，张捷平，刘如玉，吴世代，施红

(福建中医药大学中西医结合学院，福州350122)

目的从蛋白质组学方面探讨石斛合剂对2型糖尿病模型大鼠肝脏蛋白表达的影响。方法 取70只大鼠，采用高脂饲料喂养加链脲佐菌素腹腔注射的方式建立2型糖尿病模型，取其中30只分为模型组、中药组和西药组各10只，另取10只未造模大鼠作为空白组。中药组灌胃石斛合剂15 g/(kg·d)，西药组灌胃二甲双胍100 mg/(kg·d)，模型组、空白组灌胃等剂量生理盐水，均持续6周。处死各组大鼠取肝脏，提取肝脏蛋白质，采用相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术，行液相串联质谱(LC-MS/MS)分析各组大鼠的肝脏蛋白质差异性表达情况。结果 共鉴定到蛋白3 585个、肽段15 221个。与模型组相比，西药组下调蛋白数量为65种、上调蛋白数量为60种，总差异性蛋白数量为125种；中药组下调蛋白数量为195种、上调蛋白数量为157种，总差异性蛋白数量为352种。结论 石斛合剂可影响糖尿病大鼠肝脏内多种与物质代谢和细胞信号转导相关蛋白的表达，可能是其治疗糖尿病的机制之一。

2型糖尿病；肝脏；蛋白质组学；同位素标记

糖尿病是严重影响人类健康的代谢类疾病，其中2型糖尿病占90%以上。中药在糖尿病治疗及并发症的预防方面具有独特的优势。本课题组前期研究表明，石斛合剂在动物实验及临床应用方面对糖尿病均具有良好的治疗效果[1～4]。但石斛合剂治疗糖尿病的机制尚不明确。蛋白质组学是指一种生物、细胞或组织所表达的全部蛋白质[5]。蛋白质组学技术以双向电泳技术和质谱技术为基础，近年来发展起来的相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术成为比较蛋白质组学的重要技术，被广泛应用于疾病发病机制及治疗的研究[6,7]。2014年3月～2015年5月，我们对2型糖尿病大鼠应用石斛合剂治疗，采用iTRAQ技术对大鼠治疗前后肝脏内的差异性表达蛋白质进行检测，探讨石斛合剂治疗2型糖尿病的机制。

1　材料与方法

1.1动物及材料SPF级雌性Wistar大鼠80只，体质量180～220 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。高脂饲料成分包括基础饲料、蔗糖、胆固醇、胆酸盐、猪油、蛋黄粉等。iTRAQ试剂购自美国Sciex公司；链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司；柠檬酸钠等常规试剂均为国产分析纯。

1.2模型制备及动物分组大鼠适应性饲养1周后，随机取出10只作为空白组，饲喂普通饲料。其余70只大鼠饲喂高脂饲料，连续喂养4周后，经腹腔注射STZ溶液30 mg/kg制备2型糖尿病模型，空白组不进行腹腔注射。5 d后，对造模大鼠取尾静脉血测血糖，以空腹血糖>11.1 mmol/L为2型糖尿病造模成功[8,9]。取造模成功大鼠30只，随机分为模型组、中药组、西药组各10只。

1.3干预方法造模成功后，中药组予灌胃石斛合剂15 g/(kg·d)，西药组予灌胃二甲双胍100 mg/(kg·d)，模型组、空白组予灌胃等剂量生理盐水，均持续6周。

1.4标本取材大鼠麻醉后处死，取肝脏，剪成小块后立即放入液氮中冷冻。

1.5iTRAQ检测方法[10]提取肝脏蛋白质，对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后续步骤充分酶解蛋白。采用Bradford法对蛋白进行定量测定。取肝脏蛋白100 μg，按比例加入Trypsin进行酶解，用iTRAQ试剂标记肽段。将标记后的肽段进行等量混合，使用强阳离子交换色谱(SCX)进行预分离，行液相串联质谱(LC-MS/MS)分析。

1.6差异性蛋白分析方法质谱原始文件转换成MGF格式后，利用Mascot2.4软件搜索IPI蛋白数据库对蛋白质组进行定性和定量分析。依据蛋白质丰度水平，计算各组间的相对表达比值，当差异倍数达到1.2倍以上，且经统计检验P<0.05时，视为差异性蛋白。

2　结果

2.1各组差异性蛋白数量共鉴定到蛋白3 585个、肽段15 221个。与模型组相比，西药组下调蛋白数量为65种、上调蛋白数量为60种，总差异性蛋白数量为125种；中药组下调蛋白数量为195种、上调蛋白数量为157种，总差异性蛋白数量为352种。各组主要差异性蛋白名称及表达结果见表1～6。

表1　模型组比空白组上调的主要蛋白

表2　模型组比空白组下调的主要蛋白

表3　中药组比模型组上调的主要蛋白

表4　中药组比模型组下调的主要蛋白

表5　西药组比模型组上调的主要蛋白

表6　西药组比模型组下调的主要蛋白

3　讨论

1994年澳大利亚科学家最先提出了蛋白质组的概念，随后蛋白质组学研究很快成为生命科学的前沿领域。蛋白质组技术能够高通量地对样品蛋白质进行分离和分析。对分离蛋白质的定量检测技术也经历了快速发展。目前，应用于蛋白质组学的蛋白质定量技术主要有以下几种[11]：①以双向电泳为基础的定量检测：这种技术因双向电泳技术的局限性而受到某些限制，主要体现在某些极酸极碱以及非极性蛋白质难以被检测；②采用无标记的质谱进行的定量检测：这种技术有很多优势，但目前还没有发展到大规模应用；③采用蛋白芯片技术进行的定量检测：这种方法的定量结果相当准确，但价格太高，难以大规模推广；④采用同位素标记联合质谱分析进行的定量检测：这是当前应用最多的方法，主要包括同位素亲和标记(ICAT) 技术和iTRAQ技术。ICAT技术要求待检测样品一定要含有半胱氨酸[12]，否则就无法进行检测，而iTRAQ技术的出现弥补了这个不足。iTRAQ技术是一种全新的蛋白质组学研究技术[6,7]，能够快速和高通量地对多组不同样品中蛋白质组之间的差异进行研究，并且可以较准确地进行绝对和相对定量。与传统的双向电泳技术相比，iTRAQ具有高通量、操作相对简单、定量准确、适用范围广等优点，是一种非常有前景的蛋白质组学检测方法。

石斛合剂为在长期基础和临床研究基础上经不断改良所形成的中药复方，对糖尿病、高脂血症、高血压均有较好的治疗效果[13～16]。研究表明，石斛合剂能够发挥较好的稳定降低血糖及血脂水平、促进胰岛细胞增生、多靶点延缓并发症的疗效[3,4]。通过肝组织基因表达芯片检测发现，石斛合剂可使老年糖尿病鼠近千个表达异常的已知功能基因转录水平得到恢复[17]。但在蛋白质组水平的研究尚未见报道。本研究发现，与模型组相比，西药组下调蛋白数量为65种、上调蛋白数量为60种，总差异蛋白数量为125种；中药组下调蛋白数量为195种、上调蛋白数量为157种，总差异性蛋白数量为352种，其中与糖类和脂类物质代谢和细胞信号转导相关的蛋白种类最多，提示西药组与中药组治疗糖尿病的机制及对靶蛋白的影响存在不同。

本研究结果表明，模型组出现的差异性蛋白在西药、中药治疗后均可得到部分恢复，如模型组中上调的蛋白转乙酰酶、cAMPA依赖的蛋白激酶1型调节亚基、60S核糖体蛋白L19、丝切蛋白、线粒体酰基CoA合成酶家族成员2、蛋白质二硫键异构酶A5、组蛋白H1.0、表皮脂肪酸结合蛋白等，在中药组中表达量均有所减少；而模型组中下调的含蛋白水解信号的核蛋白、 旁胸腺素、原肌球蛋白α1型H亚型、含SAP结构域的核糖体蛋白、α内磺肽1亚型、Apo E、钠偶联的中性氨基酸载体3等蛋白在中药组中表达量有所上升，在西药组中也存在类似现象，但蛋白种类有所差别，这表明石斛合剂与二甲双胍治疗糖尿病的机制有所差别。

综上所述，利用iTRAQ技术可以检测到石斛合剂治疗的糖尿病大鼠肝脏蛋白质差异性表达的变化，造成的差异性蛋白既包括与物质代谢有关的蛋白，也包括没有直接参与物质代谢或细胞信号转导途径的蛋白，可能是其治疗糖尿病的机制之一。

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福建省医药卫生科技创新项目(2014-CX-29)。

施红(E-mail: shihong3327@sina.com.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.30.012

R587.1

A

1002-266X(2016)30-0039-04

2016-01-15)