西格列汀对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏IRS2/PI3K信号通路的影响

申甜，雷涛，徐碧林，章志建，张翠平

(上海市普陀区中心医院，上海200062)



西格列汀对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏IRS2/PI3K信号通路的影响

申甜，雷涛，徐碧林，章志建，张翠平

(上海市普陀区中心医院，上海200062)

目的探讨西格列汀对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝脏胰岛素受体底物2(IRS2)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路的影响。方法 取35只大鼠，应用高脂饲料喂养8周构建NAFLD模型，取其中30只随机分为二甲双胍组、西格列汀组、模型组各10只，分别以二甲双胍500 mg/(kg·d)、西格列汀10 mg/(kg·d)、等体积生理盐水灌胃8周。另取5只未造模大鼠作为对照组，以等体积生理盐水灌胃8周。各组干预后，腹主动脉采血，检测血清空腹血糖(FBG)、肝功能指标(包括ALT、AST)、血脂指标(包括TC、TG)水平，采用酶联免疫吸附法检测血清FINS水平，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。取出肝脏称重，计算肝指数(肝脏湿重/体质量)。制备肝脏匀浆，检测肝脏TG水平。取肝右叶组织行HE染色，观察肝细胞脂肪变性程度、炎性活动度及肝纤维化程度。采用RT-PCR法检测肝组织IRS2 mRNA表达，采用Western blot法检测肝组织PI3K-p85α蛋白表达。结果 模型组肝指数、FBG、HOMA-IR、ALT、AST、TC、TG及肝脏TG 水平均高于对照组(P均<0.05)；二甲双胍组及西格列汀组肝指数、FBG、HOMA-IR、ALT、AST、TC、TG及肝脏TG 水平均低于模型组(P均<0.05)；西格列汀组HOMA-IR及肝脏TG 水平均低于二甲双胍组(P均<0.05)。模型组肝组织见大量炎症细胞浸润，肝细胞出现明显的小泡性脂肪变性；二甲双胍组肝细胞空泡样变及细胞质疏松化较模型组减轻；西格列汀组以上病理改变较二甲双胍组减轻。与模型组相比，西格列汀组及二甲双胍组IRS2 mRNA表达增加、PI3K-p85α蛋白表达降低(P均<0.05)。西格列汀组IRS2 mRNA表达高于二甲双胍组、PI3K-p85α蛋白表达低于二甲双胍组(P均<0.01)。结论 西格列汀可明显改善高脂诱导的NAFLD大鼠肝脏脂肪沉积及IR，其机制可能与调节肝脏IRS2/PI3K信号通路有关。

二甲双胍；西格列汀；非酒精性脂肪肝；胰岛素；胰岛素受体底物2；磷脂酰肌醇3-激酶

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种无过量饮酒史，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性为主要特征的临床病理综合征。NAFLD患者常存在周围组织和肝脏的胰岛素抵抗(IR)[1]，且IR的严重程度与NAFLD的病情进展相关[2,3]。肝细胞胰岛素受体底物2(IRS2)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路异常是导致IR的最主要原因，IRS2(-/-)可致外周IR及肝脏抵抗。p85α是PI3K调解亚基，其过度表达可下调PI3K活性而干扰IRS2/PI3K的信号转导。新型降糖药物西格列汀是二肽基肽酶Ⅳ(DPP-4)抑制剂，除发挥降糖作用外，还有良好的降脂及改善IR作用。2015年6～12月，我们对高脂诱导的NAFLD大鼠予以西格列汀灌胃干预，以传统降糖药物二甲双胍为对照，探讨西格列汀对NAFLD大鼠肝脏IRS2及PI3K-p85α表达的影响。

1　材料与方法

1.1材料与试剂健康清洁级6～8周龄雄性SD大鼠35只，体质量(180±10)g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。高脂饲料(成分为83%基础饲料、10%猪油、5%蔗糖、1.5%胆固醇、0.5%胆盐)由上海斯莱克实验动物有限公司生产。盐酸二甲双胍(500 mg/片)购自上海施贵宝制药公司；西格列汀(100 mg/片)由默沙东公司馈赠；胰岛素及肝脏TG试剂盒购自上海博谷生物科技有限公司；逆转录试剂 PrimeScript RT购自Thermo公司；荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix EX TaqⅡ购自日本TaKaRa Bio株式会社；兔抗人PI3K-p85α抗体ab40775 abcam、预染蛋白Marker购自Thermo公司。

1.2NAFLD造模方法大鼠以普通饲料适应性喂养1 周后，再应用高脂饲料喂养8周构建NAFLD模型。造模后随机抽取5只模型组大鼠，经称重、检测血糖血脂等生化学指标及行肝组织病理检测，以体质量及肝脏湿质量明显增加，血空腹胰岛素(FINS)、稳态胰岛素评价指数(HOMA-IR)明显升高，血脂指标(包括TC、TG)及肝功能指标(包括ALT、AST)明显升高，肝脏病理组织学示肝小叶结构模糊，出现细胞肿胀、胞核消失或脂肪空泡，为NAFLD造模成功。

1.3动物分组及干预方法将NAFLD造模成功大鼠按随机数字表法分为二甲双胍组、西格列汀组、模型组各10只，分别以二甲双胍500 mg/(kg·d)、西格列汀10 mg/(kg·d)、等体积生理盐水灌胃8周。另取同龄5只未造模大鼠作为对照组，以等体积生理盐水灌胃8周。

1.4肝指数、血糖、肝功能、血脂及肝脏TG水平检测 干预8周后，各组于末次给药后，禁食12 h，行乙醚腹腔麻醉，称重。腹主动脉采血，分离血清后，迅速取出肝脏并称重，计算肝指数=肝脏湿重/体质量。采用日本Olympus公司AU2700型全自动生化检测仪,检测血清空腹血糖(FBG)、肝功能指标(包括ALT、AST)、血脂指标(包括TC、TG)水平。采用酶联免疫吸附法检测血清FINS水平，计算HOMA-IR。以氯仿：甲醇(2∶1)的比例制备肝脏匀浆，应用TG测定试剂盒检测肝脏TG水平。

1.5肝组织病理学观察取肝右叶组织约2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm制备石蜡切片，行HE染色，观察肝细胞脂肪变性、炎性改变及肝纤维化情况。

1.6肝组织IRS2 mRNA表达检测采用RT-PCR法。TRIzol法抽提大鼠肝脏总RNA，按SuperscriptⅢ逆转录酶试剂盒说明逆转录得到cDNA。引物设计和合成： IRS2基因序列均从GenBank中获取，引物用Primer5.0软件进行设计： IRS2上游5′-ATCGATGGCCTTCTCTCTCCA-3′，下游5′-ATCGATGGCCTTCTCTCTCCA-3′；GAPDH上游5′-CTCATGACCACAGTCCATGC-3′，下游5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′。扩增条件：95 ℃预变性30 s，95℃ 5 s、60 ℃ 34 s共40个循环。反应结束后，ABI7300 SDS Software自动分析荧光信号并将其转换Ct值。以GAPDH作为内参基因，对所有样品进行规一化处理，ΔCt为目的基因Ct值与内参Ct值的差值，以2-ΔΔCt为目的基因相对表达量。

1.7肝组织PI3K-p85α蛋白表达检测采用Western blot法。将少许肝组织裂解、离心、提取核蛋白，预先甲醇处理PVDF膜，然后将膜贴于凝胶上，在100 V电压下转印。用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1 h，加入稀释好的PI3K-p85α一抗抗体，4 ℃过夜，TBST洗膜3次，加入稀释好的兔抗大鼠IgG二抗抗体(1∶5 000)，振荡孵育。使用超敏化学发光液在暗示中处理，看到荧光后用感光胶片按压，显影、定影后，用Image Plus Pro 6.0系统测定灰度值。

2　结果

2.1各组肝指数、血糖、肝功能、血脂及肝脏TG水平比较模型组肝指数、FBG、HOMA-IR、ALT、AST、TC、TG及肝脏TG 水平均高于对照组(P均<0.05)；二甲双胍组及西格列汀组的肝指数、FBG、HOMA-IR、ALT、AST、TC、TG及肝脏TG 水平均低于模型组(P均<0.05)；西格列汀组HOMA-IR及肝脏TG 水平均低于二甲双胍组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组肝指数、血糖、肝功能、血脂及肝脏TG水平比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与二甲双胍组比较，△P<0.05。

2.2肝组织病理学观察模型组肝组织呈渔网状，肝小叶内及汇管区可见大量以单核、淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，肝细胞出现明显的小泡性脂肪变性，细胞水肿，出现较多气球样变；所有标本均未见肝纤维化。二甲双胍组肝小叶结构有少量紊乱，但肝细胞空泡样变及细胞质疏松化较模型组略有减轻，未见肝细胞坏死。西格列汀组病理改变较二甲双胍组减轻。

2.3各组肝组织IRS2 mRNA 、PI3K-p85α蛋白表达比较 与模型组相比，西格列汀组及二甲双胍组IRS2 mRNA表达增加、PI3K-p85α蛋白表达降低(P均<0.05)，西格列汀组IRS2 mRNA表达高于二甲双胍组、PI3K-p85α蛋白表达低于二甲双胍组(P均<0.01)。见表2。

表2　各组肝组织IRS2 mRNA及PI3K-p85α蛋白表达比较±s)

注：与模型组比较，#P<0.05；与二甲双胍组比较，*P<0.05。

3　讨论

近年来，NAFLD发病率逐年增高且呈年轻化趋势，我国成年人NAFLD的患病率达9.4%～33.5%，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝脏疾病[4]。因此，了解关于NAFLD发病机制，对延缓脂肪肝的进展有重要意义。NAFLD具有复杂的遗传背景和环境因素，主要发病机制至今尚未完全明确，其中二次打击学说[5]被认为是目前解释NAFLD发病机制最成熟的学说。以IR为中心环节导致的肝细胞脂肪变性、肝脏脂肪沉积是NAFLD发病中的首次打击，而在此基础上发生的、以线粒体反应氧体系为核心的氧化应激和脂质过氧化对肝脏的损伤是NAFLD发病的第二次打击。本研究发现，模型组HOMA-IR、ALT、AST、TG、TC、肝脏TG均高于对照组，肝组织出现明显的小泡性脂肪变性、细胞水肿、气球样变、局部炎性浸润，提示NAFLD大鼠出现明显的IR、肝功能障碍及肝脏TG沉积，肝细胞出现脂肪变性及部分炎症改变。

IR引起NAFLD的主要原因是脂代谢紊乱和高胰岛素血症，但确切病理机制尚不完全清楚。胰岛素与其受体α亚基结合，使β亚基酪氨酸激酶活化，进而使胰岛素敏感组织细胞内的胰岛素受体底物(IRS)磷酸化，从而诱发一系列生化改变[6]。研究发现，IRS2/PI3K信号通路在维持正常生理作用胰岛素与其相应受体结合的信号传导中发挥重要作用[7]。

IRS-2是IRS家族成员之一，为IRS2/PI3K途径上游的重要转录因子，在肝脏和胰岛β细胞中大量表达。IRS-2基因表达降低或基因敲除后，蛋白质表达量减少或功能障碍会影响胰岛素信号的有效传递，导致IR的发生。除IRS2之外，其通路中还包括PI3K、AKT和葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)等多个关键分子。PI3K-p85α是一个分子量为85 kD的PI3K调解亚基，其过度表达能够竞争性抑制p85-p110二聚体与胰岛素受体底物IRS的结合，从而抑制PI3K的活性[8]。P85α过度表达是诱导IR出现的一个早期分子步骤[9]。研究发现，敲除小鼠p85基因使p85α表达下调后，可明显改善IR。实验证实，在IR大鼠中，肝脏、肌肉组织中PI3K的表达均明显减少或消失，提示IRS2/PI3K信号通路在IR发生中发挥重要作用[10～16]。高脂饲养可导致成年大鼠体内IRS2/PI3K信号通路传导减弱，出现IR[17]。

作为新型的降糖药物DPP-4抑制剂西格列汀，可通过选择性抑制DPP-4而减少胰高血糖素样多肽-1(GLP-1)降解，延长GLP-1作用时间，具有促进胰岛素分泌、降低血糖及改善胰岛功能的作用。临床研究表明，对合并NAFLD的2型糖尿病患者使用DPP-4抑制剂单药或联合干预治疗后，在血糖控制较理想的同时，血脂、肝功能也有较明显的改善。Shirkawa等[18]研究发现，西格列汀对高脂饮食诱导的NAFLD小鼠具有较好的疗效，可降低HOMA-IR、肝组织SREBP-1 /PPARα比值、肝内脂肪含量，可能与西格列汀干预后使肝内脂肪酸合成减少、氧化分解代谢增强有关。本研究发现，西格列汀组肝指数、FBG、HOMA-IR、ALT、AST、TC、TG及肝脏TG 水平均低于模型组，西格列汀组HOMA-IR及肝脏TG 水平均低于二甲双胍组，提示西格列汀可降低NAFLD大鼠的肝指数、FBG、HOMA-IR、血清ALT、AST、TG、TC、FBG水平，且西格列汀改善肝脏脂肪变性及减少肝脏TG的作用优于二甲双胍；与模型组相比，西格列汀组及二甲双胍组IRS2 mRNA表达增加、PI3K-p85α蛋白表达降低，西格列汀组IRS2 mRNA表达高于二甲双胍组、PI3K-p85α蛋白表达低于二甲双胍组，提示西格列汀可能通过改善IRS2/PI3K信号通路的下游分子传导，减少游离脂肪酸在肝脏的堆积，减轻肝细胞脂肪变及肝脏IR的发生，从而抑制NAFLD进展。

综上所述，NAFLD大鼠肝脏出现IRS2/PI3K信号通路异常改变，西格列汀可上调IRS2 mRNA及抑制PI3K-p85α蛋白表达，改善IRS2/PI3K信号通路，从而改善IR及逆转肝脏脂质沉积，且效果优于二甲双胍。

[1] Haukeland JW, Konopski Z, Linnesta DP, et al. Abnormal glucose tolerance is a predictor of steatohepatitis and fibrosis in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J] . Scand J Gastroenterol, 2005,40(12):1469-1477.

[2] 林克荣, 杨慧莹, 张志坚,等.NAFLD患者血清肿瘤坏死因子-α、脂联素水平与胰岛素抵抗的相关性[J] .世界华人消化杂志, 2007,15(24):2613-2618.

[3] 梁冰,陈曦,刘双燕,等.非酒性性脂肪肝与胰岛素抵抗的关系[J].临床肝胆病杂志,2006,22(3):213-214.

[4] FAN JG. Epidemiology of non-aleoholie fatty liver disease in China[J]. J Hepatol, 2009,50(1):204-210.

[5] 沈红,柳涛,张莉,等.非酒精性脂肪肝细胞损伤敏感性的机制[J].世界华人消化杂志,2010,18(7):685-688.

[6] Pagliassotti, MJ, Kang J, Thresher A, et al. Elevated basal PI 3-kinase activity and reduced insulin signalling in sucrose-induced hepatic insulin resistance[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2002,282(1):170-176.

[7] 孙庆磊,高宏凯,张新国.肝细胞胰岛素信号传导通路与胰岛素抵抗[J].中国实用医药,2007,2(33):182-184.

[8] Mauvals JF, Vekl K, Fruman DA. Reduced expressionof the murine p85α subunit of phosphoinositide3- kinase improves insulin signaling and ameliorates diabetes[J]. J Clin Invest, 2002,109(1):141-149.

[9] Cornierm A, Bessesen DH. Nutritional upregulationof p85α expression is an early molecular manifestation of insulin resistance[J].Diabetologia, 2006,49(4):748-754.

[10] Zhu S, Sun F, Li W, et al. Apelin stimulates glucose uptake through the P13K/Akt pathway and improves insulin resislance in 3T3I, adipocytes[J]. MoCeII Bioehem, 2011,353(1):305-313.

[11] Feng XT, Wang TZ, Leng J, et al. Palmitate contributes to insulin resistance through downregulation of the Src mediated phosphoryIation of Akt in C2C12 myotubes[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2012,76(7):1356-1361.

[12] Wet Z, Peterson JM, Lei X, et al. Clq/TNF-related protein-12(CTRPl2), a novel adipokine that improves insulin sensitivity and glycemic control in louse models of obesity and diabetes[J]. J Binl Chem, 2012,287(13):10301-10315.

[13] Hashikawa HN, Hashikawa N, Noue Y, et al. Candesarta cilexetil improves angiotensin Ⅱ type 2 receptor-mediated neurite outgrowth via the P13K Akt pathway in fructose induced insulin-resistant rats[J]. Diabetes, 2012,61(4):925-932.

[14] Shen XX，Li HL，Pan L, et al．Glucotoxicity and a cell dysfunction：involvement of the P13K/Akt pathway in glucose-induced insulin resistance in rat islets and clonal aTCl-6 cells[J]. Endocr Res, 2012,37(1):12-24.

[15] Zeng XQ, Zhang CM, Tong ML, et al. Knockdown of NYGGF4 increases glucose transport in C2C1 2 mice skeletal myocytes by activation IRS-1/P13K/AKT insulin pathway[J]. J Bioenerg Biomembr, 2012,44(3):351-355.

[16] G-allagher EJ, Fierz Y, Vijayakumar A, et al. Inhibiting P13K reduces mammary tumor growth and induces hyperglycemia in a mouse model of insulin resistance and hype rinsullnemia[J]. Oncogene, 2012,31(27):3213-3222.

[17] 王冰,李宏亮,杨文英,等.胰岛素信号通路在高游离脂肪酸所致的β细胞功能紊乱中的作用及机制[J].北京大学学报(医学版),2007,39(5):462-466.

[18] Shirkawa J, Fujii H, Ohnuma K, et al. Diet-induced adipose tissue inflammation and liver steatosis are prevented by DPP-4 inhibition in diabetic mice[J]. Diabetes, 2011,60(4):1246-1257.

Influence of sitagliptin on IRS2/PI3K signal pathway in liver tissues of NAFLD rats

SHENTian,LEITao,XUBilin,ZHANGZhijian,ZHANGCuiping

(ShanghaiPutuoDistrictCentralHospital,Shanghai200062,China)

ObjectiveTo explore the effect of sitagliptin on liver insulin receptor substrate-2/phosphatidylinositol 3-kinase (IRS2/PI3K) signal pathway in rats with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD).MethodsThirty-five SD rats were selected to establish NAFLD models by 8-week high-fat diet feeding, after that 30 NAFLD rats were chosen and were divide into 3 groups: the metformin group, sitagliptin group and model group which were treated with 500 mg/( kg/d) metformin, 10 mg/( kg/d) sitagliptin and equal volume of saline by gavage for 8 weeks. Meanwhile, another 5 rats were treated with normal saline as the control group. Blood samples were obtained from abdominal aorta after 8-week treatment, the fasting blood-glucose (FBG), ALT, AST, TC, TG and insulin (FINS) level were measured by ELISA method, and the homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) index was calculated. We took out the liver, weighed and calculated the liver index (liver wet weight/body mass). Liver homogenate was prepared to detect TG level in liver. HE staining was carried out to observe the degree of liver fatty degeneration, inflammatory activity and degree of hepatic fibrosis. IRS2 mRNA was measured by using RT-PCR and the expression level of PI3K-p85α was determined by Western blotting. ResultsThe liver index, FBG, HOMA-IR, ALT, AST, TC, TG and liver TG level were higher in the model group than those of the control group (allP<0.05). The liver index, FBG, HOMA-IR, ALT, AST, TC, TG and liver TG content were reduced significantly in the metformin and sitagliptin groups as compared with those of the model group (allP<0.05). What′s more, the HOMA-IR and hepatic TG content of the sitagliptin group was lower than that of the metformin group (allP<0.05). In the model group, there was a large amount of inflammatory cell infiltration in hepatic tissues and microvesicular fatty degeneration in the hepatocytes. The hepatic cell vacuolar degeneration and cytoplasm osteoporosis of the metformin group were alleviated as compared with thsoe of the model group. The pathological change was relieved in the sitagliptin group as compared with that of the metformin group. Compared with the model group, the expression of IRS2 mRNA was increased and PI3K-p85α protein was decreased significantly in the sitagliptin and metformin groups (allP<0.05). IRS2mRNA expression was higher and PI3K-p85α protein expression was lower in the sitagliptin group than that of the metformin group, respectively (allP<0.01).ConclusionSitagliptin could significantly improve the liver pathological changes and liver TG contents of NAFLD rats induced by high-fatty diet, and the mechanism could be related with adjusting the signal pathway of IRS2/PI3K in the liver.

metformin; sitagliptin; non-alcoholic fatty liver disease; insulin receptor substrate-2; phosphatidylinositol 3-kinase

上海市卫生局青年科研项目(2013Y079)；上海市中医药大学后备业务专家培养计划项目(B-X-79)。

申甜 (1980-)，女，主治医师，主要研究方向为肥胖及胰岛素抵抗。E-mail: shentian2017@163.com

简介：雷涛(1964-)，男，主任医师，主要研究方向为脂代谢紊乱。E-mail: leitao5899@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.30.004

R587.1

A

1002-266X(2016)30-0013-04

2016-03-31)