WTX与NME1在结直肠癌组织中的表达变化及其关系探讨

陈文静，徐家辉，徐阳微，张庆玲，2

(1 南方医科大学南方医院，广州510515；2南方医科大学基础医学院)



WTX与NME1在结直肠癌组织中的表达变化及其关系探讨

陈文静1,2，徐家辉1，徐阳微1，张庆玲1，2

(1 南方医科大学南方医院，广州510515；2南方医科大学基础医学院)

目的观察X染色体上的肾母细胞瘤基因(WTX)与转移性基因23-H1(NME1)在结直肠癌组织中的表达变化，并分析二者的关系。方法 收集新鲜结直肠癌及配对的癌旁正常结直肠组织各20例，采用qRT-PCR及免疫组化法分别检测WTX和NME1 mRNA及蛋白，分析二者表达的相关性；取人结直肠癌细胞株SW480、HCT116，采用免疫共沉淀法判定二者是否存在相互结合作用。结果 WTX基因在正常结直肠组织中相对表达量为5.917±3.580，明显高于结直肠癌组织中的表达(0.785±0.238)，差异均具有统计学意义(t=6.367，P=0.000)。NME1基因在正常结直肠组织中相对表达量为2.862±1.181，明显高于结直肠癌组织中的表达(0.810±0.296)，差异均具有统计学意义(t=7.236，P=0.000)。WTX与NME1蛋白在结直肠癌组织中的阳性表达率分别为15%、10%，明显低于癌旁正常结直肠组织的75%、70%(χ2=14.545，P=0.000；χ2=6.696，P=0.019)。在结直肠癌组织中，WTX和NME1蛋白表达呈正相关(r=0.793，P=0.000)。在SW480、HCT116细胞中，WTX抗体不能将NME1沉淀下来，NME1抗体也不能将WTX沉淀下来。结论 WTX与NME1表达缺失与结直肠癌的发生相关，二者表达呈明显的正相关，但无相互结合作用。

结直肠癌；X染色体上的肾母细胞瘤基因；转移性基因23-H1；免疫共沉淀；相互作用

结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，在西方国家的发病率和病死率位居所有肿瘤的第3位，严重威胁人们的健康[1,2]。然而，结直肠癌发生及发展的具体机制仍不清楚，寻找与其发生相关的肿瘤标志物具有重要意义。X染色体上的肾母细胞瘤基因(WTX)是首个被发现定位于X染色体上的抑癌基因，转移性基因23-H1(NME1)也是一种肿瘤抑制基因。目前研究表明，WTX与NME1基因的缺失或突变与多种恶性肿瘤的发生及发展密切相关[3～12]，但二者表达与结直肠癌发生的关系尚不清楚。2013年12月～2014年12月,我们观察了WTX与NME1在结直肠癌组织中的表达变化，并分析二者的关系。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1组织标本收集南方医院同期切除的结直肠癌患者手术标本，包括癌及癌旁正常组织(距癌组织10 cm的正常结直肠黏膜组织)各20例。新鲜标本置于-80 ℃冰箱保存，其余部分标本以4%甲醛固定，脱水脱蜡制成组织蜡块，室温保存。

1.1.2细胞来源人结直肠癌细胞株SW480、HCT116为南方医科大学病理实验室自存。

1.1.3生物试剂RPMI 1640培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自BI公司；WTX抗体为本课题组制备，NME1抗体购自Abcam公司，HRP标记的山羊抗鼠/兔二抗、RIPA全蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、5×SDS蛋白上样缓冲液、化学发光液购自弗德公司；PVDF膜购自Millipore公司，蛋白A/G琼脂糖购自Santa Cruz公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Bioworld公司，TRIzol试剂、逆转录试剂盒、荧光定量试剂来自TaKaRa试剂公司。免疫组化试剂盒购买自北京中杉金桥公司，荧光定量PCR引物购自英潍捷基公司。

1.2实验方法

1.2.1WTX与NME1基因检测采用qRT-PCR法。①组织总RNA提取：取绿豆大小的组织，以TRIzol裂解提取RNA，并检测RNA浓度。②逆转录反应：按照TaKaRa逆转录的试剂盒说明书冰上进行操作，混匀配制反应体系；在37 ℃反应约15 min，85 ℃灭活约5 s，将所得反转录的产物置于-20 ℃保存，备用。③荧光定量PCR反应：使用Primer 5.0软件设计引物，WTX上游引物5′-GACCCAAAAGG-ATGAAGCT-3′，下游引物 5′-CCCCTCCAAAGAAACTAGGC-3′；NME1上游引物5′-TTAATCAGATGGTCGGGGAT-3′，下游引物5′- GATCTATGAATGACAGGAGG-3′；GAPDH上游引物5′-ACAGCCCGCAGGATCAGGAAA-3′，下游引物5′-AACACGCTTCACGGGCACTC-3′。按照TaKaRa RT-PCR试剂盒的说明书配制反应体系，反应条件为95 ℃预变性约10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，共40个循环。以2-ΔΔCt来表示目的基因相对表达量，实验重复3次。

1.2.2WTX与NME1蛋白检测采用免疫组化法。以2 μm厚切片，65 ℃烤片6 h;二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水,流水冲洗后浸泡于PBS中；抗原修复后行山羊血清封闭，滴加适当比例稀释的抗体37 ℃孵育2 h(鼠抗人NME1抗体1∶100，兔抗人WTX抗体1∶25)。PBS冲洗后滴加生物素标记的通用鼠/兔二抗，室温孵育30 min；PBS冲洗后行DAB显色剂显色，苏木素中室温染色，中性树胶封片。阳性细胞定位于肠上皮细胞及间质细胞，呈棕黄色。染色强度无色、淡黄色、黄色、棕黄色分别计0、1、2、3分，阳性细胞百分比﹤1%、1%～﹤25%、25%～﹤50%、50%～﹤75%、≥75%分别计0、1、2、3、4分。两项得分相加0～3分定义为阴性，4～7分定义为阳性。

1.2.3WTX与NME1蛋白相互作用观察采用免疫共沉淀法。将SW480、HCT116细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养。①细胞蛋白抽提：收集生长状态良好的SW480及HCT116，加入预冷的用于IP的温和裂解液RIPA Buffer，并按每1 mL RIPA Buffer加入10 μL磷酸酶抑制剂，1 μL蛋白酶抑制剂和5 μL 100 mmol/L PMSF；用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。②免疫共沉淀WTX或NME1相关蛋白：取30 μL全蛋白做Input(阳性对照组)，剩下的蛋白每1 mL总蛋白加入20 μL 蛋白A/G琼脂糖原液以去除非特异性；剩余的蛋白平分为两组，分别为实验组及阴性对照组。在实验组中按照2 μg WTX/NME1抗体∶1 000 μL总蛋白加入WTX/NME1抗体；在阴性对照组中按照2 μg IgG∶1 000 μL总蛋白加入IgG抗体；缓慢翻转抗原抗体混合物4 ℃过夜；加入蛋白A/G琼脂糖30 μL捕捉抗原抗体复合物，4 ℃缓慢翻转抗6 h；收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，PBS洗5遍；2×上样缓冲液40 μL将琼脂糖-抗原抗体复合物悬起，混匀；上样样品煮沸5 min游离抗原、抗体、琼脂糖，14 000 r/min瞬时离心5 s，将上清电泳，其余冻存于-80 ℃。③Western blot检测：蛋白样品经过10%SDS-PAGE电泳，再电转至PVDF膜；5%脱脂牛奶封闭1 h，4 ℃冰箱内孵育一抗过夜：anti-WTX(稀释体积比1∶100)及anti-NME1(稀释体积比1∶1 000)过夜；PBST洗5 min×5次，二抗(稀释比例为1∶5 000)室温孵育1 h。PBST洗5 min×5次；ECL发光液孵育后置于UVP成像系统成像。实验重复3次。如果WTX及NME1抗体能分别将NME1及WTX蛋白沉淀，表示二者存在相互结合作用；如果不能，表示二者不存在相互结合的关系。

1.3统计学方法采用SPSS20.0统计软件。qRT-PCR结果采用配对样本t检验，免疫组化结果中样本率的比较采用χ2检验，两样本的相关性分析采用Spearman相关性分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1结直肠癌及癌旁正常组织中WTX及NME1基因相对表达量比较qRT-PCR检测结果显示，WTX基因在正常结直肠组织中相对表达量为5.917±3.580，明显高于结直肠癌组织中的表达(0.785±0.238)，差异具有统计学意义(t=6.367，P=0.000)。NME1基因在正常结直肠组织中相对表达量为2.862±1.181，也明显高于结直肠癌组织中的表达(0.810±0.296)，差异具有统计学意义(t=7.236，P=0.000)。

2.2结直肠癌及癌旁正常组织中WTX及NME1蛋白比较及其相关性WTX在结直肠癌组织中的阳性表达率为15%，明显低于癌旁正常组织的75%(χ2=14.545，P=0.000)。NME1在结直肠癌组织中的阳性表达率为10%，也明显低于癌旁正常结直肠组织的70%(χ2=6.696，P=0.019)。WTX和NME1在结直肠癌组织中的表达呈正相关(r=0.793，P=0.000)，而其在正常结直肠组织中的表达无明显相关关系(r=0.126，P=0.597)。

2.3结直肠癌细胞中WTX及NME1的作用关系结果表明，WTX抗体并不能将NME1沉淀下来，NME1抗体也不能将WTX沉淀下来，提示WTX与NME1无相互结合作用。

3　讨论

WTX及NME1均为肿瘤抑制基因，目前的研究均表明其与多种恶性肿瘤的发生及发展密切相关[3～6, 9～12]。其中，WTX是首个被发现定位于X染色体上的抑癌基因，全长3 405 bp，在胃癌、肝癌中均表达缺失，其作用机制与p53及Wnt/β-catenin信号通路有关[5, 7, 13]。NME1是核苷二磷酸激酶家族蛋白成员之一，位于17q21.3，参与多种生物学进程，如肿瘤细胞的黏附、生长及侵袭，其发挥作用的机制主要涉及Akt、MAPK/Erk1/2及NF-κB等信号通路[14]。然而，关于WTX及NME1在结直肠癌组织中的表达情况目前尚未见报道，其表达是否参与结直肠癌的发生也尚不明确。为了明确WTX及NME1表达与结直肠癌发生的关系，我们进行了本研究。

注：A为以WTX抗体免疫沉淀NME1；B为以NME1抗体免疫沉淀WTX。

图1免疫共沉淀检测WTX与NME1的结合关系

在本研究中，我们首先通过qRT-PCR检测了20例配对结直肠癌及癌旁正常组织中WTX及NME1在基因水平的表达情况，结果显示WTX及NME1基因在结直肠癌组织中的表达明显低于癌旁正常结直肠组织。提示WTX及NME1在结直肠癌组织中存在着转录水平的表达缺失，其表达的缺失可能与结直肠癌的发生相关。随后，我们也通过免疫组化检测了20对配对结直肠癌及癌旁正常结直肠组织中WTX及NME1蛋白水平的表达情况，结果显示WTX与NME1蛋白在结直肠癌组织中的阳性表达率均明显低于癌旁正常结直肠组织。提示WTX及NME1在结直肠癌组织中也存在着蛋白水平的表达缺失。qRT-PCR及免疫组化的结果一致，表明WTX及NME1表达的缺失与结直肠癌的发生相关。

同时，我们发现WTX和NME1在结直肠癌组织中的表达呈明显的正相关，可能由于样本量小的原因，在正常组织中并没有发现WTX和NME1的相关性。为此，我们推测WTX和NME1可能存在着相互结合，发挥协同作用，共同参与结直肠癌的发生。为了探讨NME1与WTX是否存在着相互结合，我们进行了免疫共沉淀实验。免疫共沉淀法是非常有效的筛选蛋白复合物的实验，可真实反映正常生理条件下蛋白质间的相互作用。该技术既可用来验证已知蛋白间的相互作用，又可用于验证已知蛋白与未知蛋白间的相互作用[15]。然而，免疫共沉淀结果显示，在两种人结直肠癌细胞株中，WTX抗体不能将NME1沉淀下来，NME1抗体也不能将WTX沉淀下来。提示WTX与NME1并不能直接形成蛋白复合物发挥作用，二者可能是通过不同的分子机制参与调控结直肠癌的发生。

综上所述，WTX与NME1表达缺失与结直肠癌的发生相关，其表达呈正相关，但二者无相互结合作用。WTX与NME1可能为结直肠癌早期诊断及筛查的潜在靶点，其表达的检测具有重要的临床意义。当然，由于本研究纳入的样本量较小，具有一定的局限性，因此，仍需要后续实验研究的证实。

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Expression and correlation between WTX and NME1 in colorectal cancer tissues

CHENWenjing1,XUJiahui,XUYangwei,ZHANGQingling

(1NanfangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

ObjectiveTo observe the expression changes of WTX and NME1 in chromosome X of colorectal cancer tissues and to analyze the correlation between them. MethodsThe mRNA and protein expression and correlation between WTX and NME1 was analyzed in 20 cases of human colorectal cancer and matched adjacent normal colorectal tissues by qRT-PCR and immunohistochemistry, respectively. Then, the colorectal cancer cell lines SW480 and HCT116 were selected to detect whether there was interaction between WTX and NME1 by co-immunoprecipitation assay. Results The expression of WTX in normal colorectal tissues was 5.917±3.580, which was significantly higher than that (0.785±0.238) in the matched colorectal cancer with a significant difference (t=6.367,P=0.000). The relative expression of NME1 in normal colorectal tissues was 2.862±1.181, which was significantly higher than that (0.810±0.296) in matched colorectal cancer with a significant difference (t=7.236,P=0.000). The positive expression rate of WTX in colorectal cancer was 15%, which was significantly lower than that in adjacent normal colorectal tissues (75%,P=0.000). The positive expression rate of NME1 in colorectal cancer was 10%, which was significantly lower than that in the adjacent normal colorectal tissues (70%,P=0.019). Meanwhile, WTX was positively correlated with NME1 in colorectal cancer (r=0.793,P=0.000). However, co-immunoprecipitation assay showed WTX did not directly interacted with NME1. ConclusionWTX and NME1 depletion is related to the occurrence of colorectal cancer, and they present positive correlation but do not have interacted binding effect.

colorectal carcinoma; WTX gene; neoplasm metastasis23 H1; co-immunoprecipitation; interaction

国家自然科学基金资助项目(81272760，81071989)。

陈文静(1989-)，女，在读硕士，主要研究方向为结直肠癌转移的分子机制。E-mail： 570461152@qq.com

简介：张庆玲(1970-)，女，教授，主要研究方向为胃肠肿瘤发生发展的分子机制。E-mail： zqllc8@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.002

R735.3

A

1002-266X(2016)34-0004-04

2016-04-15)