VDR基因FokⅠ多态性与新疆维吾尔族、汉族儿童急性白血病易感性的关系

刘玉,古丽巴哈·买买提，严媚，王珍珍

(新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐830054)



VDR基因FokⅠ多态性与新疆维吾尔族、汉族儿童急性白血病易感性的关系

刘玉,古丽巴哈·买买提，严媚，王珍珍

(新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐830054)

目的探讨维生素 D 受体(VDR)基因FokⅠ多态性与新疆维吾尔族、汉族儿童急性白血病(AL)的关系。方法 采用病例对照研究设计，对新疆医科大学第一附属医院儿科AL患儿125例(维吾尔族60例，汉族65例)及130例(维吾尔族63例，汉族67例)同期健康体检儿童，用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)法检测VDR基因FokⅠ多态性。结果 新疆维吾尔族及汉族健康儿童FokⅠ的基因型及等位基因分布差异无统计学意义(χ2=3.289，P=0.193)，但其等位基因分布差异有统计学意义(χ2=4.882，P=0.028)。在维吾尔族AL患儿和健康儿童中TT/CC+CT基因型分布差异无统计学意义(χ2=1.089，P=0.297),等位基因分布差异亦无统计学意义(χ2=2.133，P=0.144)。在汉族AL患儿和健康儿童中TT/CC+CT基因型分布差异有统计学意义(χ2=6.453，P=0.011)，等位基因分布差异亦有统计学意义(χ2=11.239，P=0.001)。结论VDR基因FokⅠ多态性分布在AL患儿中存在民族差异；VDR基因FokⅠ多态性与新疆维吾尔族AL患儿无明显相关性，而与汉族儿童AL的发生具有相关性。

维生素D受体;基因多态性；儿童；白血病；维吾尔族；汉族；新疆

维生素D是脂溶性维生素，对人类健康特别是对儿童健康具有重要意义。维生素D缺乏除了导致钙、磷代谢异常外，还可影响神经、肌肉、免疫、造血等多种组织器官的功能[1]。活性维生素D主要是通过与维生素D受体(VDR)结合发挥其生物学作用。王哲等[2]研究显示，VDR是维生素D作用于细胞的关键调节因子。研究表明，VDR或者其天然配基1,25-羟基维生素D3可以调节肿瘤的生长。近十几年来，人们先后在多种白血病细胞系中发现有VDR表达。因此，我们有理由认为白血病细胞是维生素D和VDR作用的靶细胞，VDR基因可能是白血病的易感基因。目前，有关VDR基因在儿童白血病中的研究报道甚少。本研究意在阐述VDR基因Fok Ⅰ多态性与新疆维吾尔族、汉族儿童急性白血病(AL)易感性的关系。

1　资料与方法

1.1临床资料选取2013年9月～2015年1月在新疆医科大学第一附属医院儿科住院的125例AL患儿，男58例，女67例；年龄28 d～14岁，平均3.56岁；维吾尔族60例，汉族65例；个体间均无血缘关系。所有病例通过MICM分型，并除外其他癌症及合并糖尿病、心血管疾病等。选取同期在儿科预防保健门诊体检的130例非白血病儿童作为对照，男63例，女67例；年龄28 d～14岁，平均3.56岁；维吾尔族63例，汉族67例。AL患儿与健康儿童性别、年龄、民族组成具有可比性(P均>0.05)。

1.2VDR基因FokⅠ多态性分析方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)法。PCR 上下游引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，限制性内切酶由美国 MBI公司生产，PCR Master Mix及100 bp DNA Ladder Marker、10×TBE电泳缓冲液由大连宝生物工程有限公司生产。琼脂糖和溴化乙锭(EB)分别由Biowest公司和Sigma 公司生产。采集外周新鲜静脉血 1～2 mL，EDTA抗凝，进行DNA提取。引物序列：通过美国国家生物信息中心 (NCBI)的GeneBank获取VDR基因序列及Fok Ⅰ位点的单核苷酸多态性信息，利用 Primer 5.0 软件设计引物序列。FokⅠ上游引物5′-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3′，下游引物5′-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3′。PCR扩增：PCR反应体系包括DNA模板0.2 μg，上下游引物各0.2 μL，Premix Taq 10 μL，灭菌双蒸水补足反应总体积至20 μL。将以上体系首先94 ℃预变性5 min；然后 94 ℃变性 45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸 5 min，共 30个循环；最后 72 ℃延伸 5 min形成PCR 扩增产物。PCR-RFLP 分析：取 PCR 产物 10 μL，加入 0.2 U相应的限制性内切酶及相应的缓冲液，恒温 37 ℃水浴箱中酶切 90 min。酶切产物于 2%的琼脂糖凝胶上电泳 30 min，用凝胶图像分析系统分析基因型。随机抽取经 PCR-RFLP 确定的不同基因型的 PCR 产物各 2 例送上海生工生物工程技术有限公司测序，测序结果采用Chromas软件读出后与 GeneBank 的序列进行对比。

1.3统计学方法采用SPSS17.0统计软件。先对健康儿童行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，对不同组的基因型和等位基因分布比较均采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1VDR FokⅠ基因型分析结果VDR基因FokⅠ的第2外显子位点多态性对应FokⅠ的酶切位点，为碱基T→C的突变。等位基因无酶切位点的纯合子仅出现265 bp 1条条带，表示为TT；只有1个酶切位点的杂合子出现265、207、60 bp 3条条带，表示为CT；有2个酶切位点的纯合子出现207、60 bp 2条条带，表示为CC。见图1。

注：M为Maker；1为CC等位基因，表现207、60 bp 2条条带；4为CT等位基因表，现为265、207、60 bp 3条条带；2、3为TT等位基因表现为265 bp 1条条带。

图1VDR的PCR产物经FokⅠ酶切后的电泳图

2.2Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果将健康儿童中汉族及维吾尔族儿童的FokⅠ基因位点的实际频数和理论频数进行χ2检验，结果显示差异无统计学意义(χ2=0.140，P=0.932,χ2=0.060，P=0.970)，表明FokⅠ基因位点符合Hardy-Weinberg遗传平衡。见表1。

2.3VDR基因FokⅠ位点多态性在健康儿童汉族及维吾尔族中的分布新疆维吾尔族及汉族健康儿童FokⅠ的基因型及等位基因分布差异无统计学意义(χ2=3.289，P=0.193)，但其等位基因分布差异有统计学意义(χ2=4.882，P=0.028)。见表2。

表2　 　　　FokⅠ基因多态性在健康儿童汉族及维吾尔族儿童中的分布(例)

2.4 VDR基因FokⅠ位点多态性在AL患儿和健康儿童的分布 在维吾尔族AL患儿和健康儿童中TT/CC+CT基因型分布差异无统计学意义(χ2=1.089，P=0.297),等位基因分布差异亦无统计学意义(χ2=2.133，P=0.144)。在汉族AL患儿和健康儿童中TT/CC+CT基因型分布差异有统计学意义(χ2=6.453，P=0.011)，等位基因分布差异亦有统计学意义(χ2=11.239，P=0.001)。见表3。

表3　VDR基因FokⅠ位点多态性在AL患儿和健康儿童的分布(例)

3　讨论

白血病的发病机制非常复杂，包括物理、化学、生物及遗传因素等。分子生物学研究已证明，AL的本质是多基因异常引起的恶性肿瘤，涉及到许多癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活，是一个多步骤的过程[3,4]。目前研究显示，遗传易感性和环境因素是儿童白血病发生的两个关键因素。多基因遗传病易感基因的定位和遗传分析，是近年来白血病多基因遗传易感性的研究重点。

在肺癌、结肠癌、食管癌、前列腺癌、胰腺癌等肿瘤生长过程中，VDR均具有调节控制作用。刘静波等[5]研究显示，VDR基因FokⅠ位点多态性与肺腺癌发病风险可能关联，提示VDR基因多态性与肺癌的发生之间存在明显相关性。有研究显示，VDR基因多态性与乳腺癌存在一定的相关关系[6]。研究显示，广西地区健康儿童FokⅠ多态性与国内其他地区人群VDR基因位点多态性分布情况基本一致[7～9]，明显不同于印度人群[10]及西班牙人群[11]。国外有研究显示[11]，FokⅠ的基因多态性位点在中国汉族人群与欧洲人群之间存在明显差异，并认为可能是中国人群结核病高发感染的原因之一。也有研究表明[12～14]，FokⅠ基因位点会影响儿童白血病的发病机制。

本研究通过对维吾尔族和汉族白血病患儿、非白血患儿的VDR不同基因型进行检测，以证实维吾尔族和汉族患儿VDR不同基因型在白血病发生中的重要作用。在儿童白血病方面，郑敏等[9]在广西汉族白血病患儿VDR基因多态性研究发现，FokⅠ位点TT基因型在AL患儿的分布较健康儿童明显增高；与CC基因型相比，TT基因型患AL的风险性增加(OR=2.260,P<0.05)；与C等位基因相比，携带T等位基因的个体更易罹患AL(OR=1.556,P<0.05)。国外的研究显示[15]，FokⅠ酶切位点的多态性与儿童白血病的遗传易感性有关。国外有体外细胞研究证实，维生素D抵抗会诱导生成白血病肿瘤细胞，VDR基因FokⅠ位点的多态性与白血病肿瘤细胞的分化形成之间关系密切[16]。在本研究中，VDR基因FokⅠ的TT/CC+CT基因型分布在非白血病患儿中不存在民族差异，但其等位基因分布存在差异，提示T及C等位基因组合的不同可产生不同的表型。TT/CC+CT基因型和等位基因分布在维吾尔族AL患儿和健康儿童中分布相近，差异亦无统计学意义。对于汉族儿童而言，TT/CC+CT基因型和等位基因分布在AL患儿和健康儿童中差异有统计学意义，此结果与文献[7～9]结论相似。提示VDR基因FokⅠ基因位点与新疆地区汉族儿童AL的发生具有相关性。提示不同地区、不同人种等的遗传因素可能不同，加之环境因素的差异，以及环境与遗传因素间的相互作用又使情况更复杂，从而导致上述结果。本研究仅限于对新疆医科大学第一附属医院的儿童，受样本量的限制，本研究尚显不足，有待进一步研究。

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新疆医科大学第一附属医院科研项目(2012QN04)。

严媚(E-mial: yan10mei25@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.029

R725.5

B

1002-266X(2016)34-0076-03

2015-12-27)