双歧杆菌乳杆菌三联活菌片对1型糖尿病肠道菌群和血清IFN-γ、IL-4的影响

牛文忠，丁显春



双歧杆菌乳杆菌三联活菌片对1型糖尿病肠道菌群和血清IFN-γ、IL-4的影响

牛文忠，丁显春

目的观察双歧杆菌乳杆菌三联活菌片对1型糖尿病(T1DM)患儿肠道菌群及血清IFN-γ和IL-4的影响。方法选取25例南阳市中心医院儿科2014年2月至2015年1月T1DM患儿为观察组，选取同时期健康体检儿童25例为对照组。入选对象年龄3～8岁。观察组给予胰岛素治疗，同时给予双歧杆菌乳杆菌三联活菌片，每次0.5 g，每日3次，口服，疗程1个月；对照组未予任何治疗措施。比较两组治疗前和治疗1个月患儿肠道菌群、血清IFN-γ及IL-4水平变化。结果治疗前观察组肠道双歧杆菌和乳杆菌均低于对照组，血清IFN-γ和IFN-γ/IL-4高于对照组(P<0.05)；观察组治疗后肠道双歧杆菌和乳杆菌均高于治疗前，血清IFN-γ和IFN-γ/IL-4低于治疗前(均P<0.05)。结论双歧杆菌乳杆菌三联活菌片可以改善T1DM肠道菌群构成，恢复Th1/Th2细胞的平衡。

双歧杆菌乳杆菌三联活菌片；1型糖尿病；肠道菌群；儿童

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是以胰岛β细胞严重破坏为特征的自身免疫性疾病，多发生于儿童和青少年，确切发病机制尚未完全阐明。遗传、免疫及环境等因素在T1DM发病过程中均起重要作用[1]。肠道是机体最大免疫器官，人类胃肠道平均含1014个·mL-1微生物，包含5 000多种细菌。研究显示，肠道菌群构成与糖尿病等多种疾病有关，健康人群和T1DM患者肠道菌群构成不同，改变肠道菌群构成可改善糖尿病发病[2]。本研究观察双歧杆菌乳杆菌三联活菌片(金双歧片)对T1DM患儿肠道菌群及细胞因子等影响，为益生菌辅助治疗T1DM寻求依据,现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料观察组为2014年2月至2015年1月南阳市中心医院儿科诊治的患者(病程<3月)25例，均符合2010年美国糖尿病学会诊断标准[3]，且依据体格检查、血浆胰岛素、C肽和自身抗体检测排除2型糖尿病。其中，男16例，女9例，年龄(5.5±1.3)岁；对照组为我院同时期健康体检儿童25例，男13例，女12例，年龄(5.5±1.4)岁，均无糖尿病及其他类型自身免疫型疾病家族史。两组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。所有受试者4周内均未应用益生菌及抗生素。本研究通过医院伦理委员会批准，患儿家属均签署知情同意书。

1.2治疗方法观察组患儿均按2010年儿童及青少年糖尿病的胰岛素治疗指南[4]给予胰岛素治疗，同时给予双歧杆菌乳杆菌三联活菌片(金双歧，内蒙古双奇药业股份有效公司)，每次0.5 g，每日3次，口服，疗程1个月。

1.3研究方法

1.3.1标本收集采集清晨空腹静脉血3 mL，离心、收集血清、编号后置于-80 ℃冰箱保存、待测；大便采用无菌棉签挑取新鲜大便约30 g，放入无菌干燥的大便盒内，30 min内送检。

1.3.2细胞因子检测采用酶联免疫吸附法(上海粤研生物科技有限公司试剂盒)检测血清IFN-γ、IL-4水平，由我院检验科专人严格遵循试剂盒说明书进行检测。酶标仪型号PHOmo(郑州安图生物工程股份有限公司)。

1.3.3肠道菌群检测称取0.1 g粪便，加入0.9 mL稀释液，震荡匀浆后，倍比稀释至8～10倍，分别于适当的稀释度取标本液100 μL，用“L”棒均匀涂抹于不同的培养基上，对双歧杆菌、乳酸杆菌及肠球菌参照傅朝晖等[5]的方法定量和定性检测。

2　结果

2.1两组肠道菌群和血清IFN-γ、IL-4比较治疗前观察组肠道双歧杆菌和乳杆菌均低于对照组(P<0.05)，肠球菌比较无统计学意义(P>0.05)；观察组血清IFN-γ和IFN-γ/IL-4高于对照组(P<0.05)，血清IL-4比较无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　两组肠道菌群、血清IFN-γ和IL-4比较

2.2观察组治疗前与治疗1月后比较治疗1个月后肠道双歧杆菌和乳杆菌均高于治疗前(P<0.05)，肠球菌比较无统计学意义(P>0.05)；治疗1个月后血清IFN-γ和IFN-γ/IL-4低于治疗前(P<0.05)，血清IL-4比较无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2　观察组治疗前、治疗1月后肠道菌群、血清IFN-γ和IL-4比较

3　讨论

肠道微生物的数量是人体细胞数量的10倍，人体微生物组的宏基因组测序显示共有330万个非冗余基因，而且其中99%以上的基因源于细菌，如此巨大的基因组，较人类基因组大150倍[6]。但包括人类在内的哺乳动物出生时不携带任何微生物，婴儿期人体肠道菌群差异很大且不稳定，1岁以后开始向成人轮廓特征发展，2.5岁时完全成型，菌群构成、分布与成人肠道水平基本一致。随后，大部分肠道内微生物保持稳定直到老年期，且保持种类和数量动态平衡[7]。不同个体肠道菌群的形成和多样性选择受多种因素影响，如宿主基因、年龄、性别、饮食和疾病等。按照菌株在宿主体内的生化反应和对宿主的作用效果可分为有益菌、双向菌和有害菌，其中有益菌是肠道的优势菌群，占99%～99.9%，如双歧杆菌、乳酸杆菌和酵母菌等。

研究表明，正常的肠道微生物对于肠道先天免疫系统的调节和免疫耐受的建立是必不可少的，肠道微生物与先天免疫系统相互作用在T1DM的发生发展中起着重要作用，肠道微生物紊乱、肠上皮细胞完整性受损以及肠道免疫功能失衡也都与T1DM的发展有影响。齐翠娟等[8]研究显示当外界环境因素发生改变时，肠道菌群正常的结构分布受到影响，影响肠壁通透性及免疫平衡，发生针对胰腺β细胞的自身免疫反应及炎症，最终导致T1DM的发生。通过益生菌等方式改善肠道菌群的结构，可延缓或改善糖尿病的发生。游春平等[9]研究显示益生菌是活的微生物补充剂，其作为一种环境因素，可能影响宿主的肠道结构完整性、代谢和免疫，从而延缓或预防T1DM发病。

T1DM是在遗传易感基因的基础上，由外界环境因素的作用引起的自身免疫反应，可导致胰岛β细胞的损伤和破坏[1]。Th1细胞功能增强并可参与某些器官特异性自身免疫性疾病的发生，Th2细胞可以拮抗自身免疫疾病的发生。IFN-γ是重要的免疫调节因子，可促发自身免疫反应信号，使细胞向Th1方向分化，Th1型细胞因子分泌增加，IL-4可以抑制活化的巨噬细胞/单核细胞功能，保护胰岛β细胞，使其避免免疫耐受的破坏。胰岛β细胞在丧失免疫耐受性后，免疫调节功能失调，刺激Th1分泌IFN-γ等细胞因子；同时，抑制Th2细胞IL-4分泌，从而导致细胞因子不平衡，致使自身β细胞成为靶细胞，其细胞膜成分成为自身免疫应答的杀伤目标，进而激活细胞毒性T细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞，产生氧自由基、一氧化氮和一些细胞因子，最终对胰岛β细胞产生直接毒性。陈永兴等研究提示vitA可能通过纠正体内Th1/Th2的平衡紊乱，保护细胞β细胞免受自身免疫反应的攻击，从而避免或减少自身免疫性糖尿病的发生[10]。

本研究显示T1DM患儿存在肠道菌群紊乱，双歧杆菌和乳杆菌水平显著低于对照组，同时由Th1细胞亚群分泌的IFN-γ显著高于对照组，而由Th2细胞亚群分泌的IL-4与对照组比较无统计学意义，IFN-γ/IL-4显著高于对照组；观察组患儿给予益生菌辅助治疗1月后肠道双歧杆菌及乳杆菌较治疗前明显升高，IFN-γ较治疗前明显降低，IFN-γ/IL-4较治疗前明显降低。提示益生菌可以改善T1DM肠道菌群构成，恢复Th1/Th2细胞平衡。

[1]王卫平.儿科学[M].第8版.北京:人民卫生出版社,2013:437-443.

[2]Kotzampassi K,Giamarellos-Bourboulis EJ,Stavrou G.Obesity as a consequence of gut bacteria and diet interactions[J].ISRN Obes,2014,2014:651895.

[3]美国糖尿病协会.ADA:糖尿病医学诊断标准-2010(摘要)[J].中国糖尿病杂志,2010,18(3):164-171.

[4]中华医学会儿科学分会内分泌遗传代谢学组,中华儿科杂志编辑委员会.儿童及青少年糖尿病的胰岛素治疗指南[J].中华儿科杂志,2010,48(6):431-435.

[5]傅朝晖,王文丽,张滨.239例老年非肠道疾病患者肠道菌群状况研究[J].重庆医学,2012,41(23):2400-2401+2404.

[6]江杨洋,王旭东.生态病因学:肠道菌群失调与2型糖尿病[J].医学综述,2014,20(20):3757-3759.

[7]尚婧晔,余倩.肠道菌群与2型糖尿病相关性的研究进展[J].中国微生态学杂志,2014,26(12):1471-1475.

[8]齐翠娟,肖新华.肠道菌群与1型糖尿病[J].中国糖尿病杂志,2015,23(6):574-576.

[9]游春苹，郭本恒，刘振民，等.益生菌应用于1型糖尿病研究中的进展[J].中国微生态学杂志，2014,26(12)：1463-1467.

[10]陈永兴,卫海燕,王凌飞,等.维生素A对1型糖尿病患儿Th1/Th2平衡的调节作用[J].实用儿科临床杂志,2010,25(21):1654-1655.

Influence of Live Combined Bifidobacterium and Lactobacillus Tablet for Intestinal Microflora and Serum IFN-γ、IL-4 in Children with Type 1 Diabetes Mellitus

NIU Wen-zhong,DING Xian-chun

(Department of Pediatrics Nanyang Central Hospital,Nanyang 473000,China)

ObjectiveTo explore the influence of live combined bifidobacterium and lactobacillus tablet for intestinal microflora and serum IFN-γ and IL-4 in children with type 1 diabetes mellitus(T1DM).Methods25 children with T1DM were selected as observation group from February 2014 to January 2015 in pediatrics department of Nanyang Central Hospital,and 25 healthy children undergoing physical examination at the same time period were selected as control group.All children aged from 3 to 8 years old.The observation group were treated with insulin and live combined bifidobacterium and lactobacillus tablet,0.5 g per time and three times per day for 1 month.The control group were without any treatment.The changes of intestinal microflora,serum IFN-γ and IL-4 levels were compared between observation group and control group.In observation group,the changes were compared between pre-treatment and 1 month post-treatment.ResultsThe quantity of bifidobacterium and lactobacillus in observation group was lower than the control group,the level of IFN-γ and IFN-γ/IL-4 in observation group was higher than the control group(P<0.05);In observation group,the quantity of bifidobacterium and lactobacillus in pre-treatment was lower than post-treatment,the level of IFN-γ and IFN-γ/IL-4 in pre-treatment was higher than post-treatment(all P<0.05).ConclusionLive combined bifidobacterium and lactobacillus tablet may improve the intestinal microflora and restore the balance of Th1/Th2 in children with T1DM.

live combined bifidobacterium and lactobacillus tablet；type 1 diabetes mellitus；intestinal microflora；children

1672-688X(2016)03-0196-03DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.03.011

2016-03-28

南阳市中心医院儿科，河南南阳 473000

牛文忠(1978-)，男，河南卫辉人，主治医师，从事小儿内分泌与遗传代谢疾病诊治工作。

R725.8

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