miR-135b在宫颈癌中的表达及临床意义

刘　平



miR-135b在宫颈癌中的表达及临床意义

刘平

目的探讨miR-135b在宫颈癌及相应癌旁组织中的表达情况及其与宫颈癌临床病理特征的相关性。方法收集26例宫颈癌和相应癌旁组织，运用RT-PCR的方法检测26例宫颈癌及相应癌旁组织中miR-135b的表达，分析miR-135b与宫颈癌临床病理特征的相关性，并评价其临床意义。结果荧光定量PCR显示宫颈癌中miR-135b的表达(8.36±3.67)比癌旁组织(6.19±2.81)明显上调(P<0.05)。miR-135b的表达与宫颈癌淋巴结转移、临床分期(Ⅲb)之间存在相关性(均P<0.05)。结论miR-135b可能在宫颈癌的发生发展中发挥重要的作用。

宫颈癌；miR-135b；临床分期；淋巴结转移

宫颈癌是全世界排名第二的女性恶性肿瘤，也是癌症死亡的主要原因之一。虽然早期宫颈癌可以通过根治手术辅以化疗或放疗得以治愈，但很多因素影响宫颈癌的预后，包括肿瘤大小、基质浸润深度、血管浸润、子宫旁组织的入侵、盆腔淋巴结转移等，其中盆腔淋巴结转移被认为是影响宫颈癌预后最重要的危险因素[1]。近年的研究表明miRNA与宫颈癌的发生发展有密切的关系，其参与调控宫颈癌的进程和雌孕激素的表达[2]。研究发现miR-135b在骨肉瘤[3]、结肠癌[4]、前列腺癌[8]等多种肿瘤中表达上升。本研究用RT-PCR的方法检测miR-135b在宫颈癌及其相应癌旁组织中的表达，并探讨其与宫颈癌临床病理特征的相关性，现报道如下。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1样本和临床资料的收集样本来自2013年7月至2015年12月在南阳市第二人民医院妇科26例宫颈鳞状细胞癌行根治性子宫切除术和盆腔淋巴结清扫的样本和临床资料，年龄28～66岁。根据国际妇产科联合会(Federation International of Gynecology and Obstetrics,FIGO)诊断标准，26例中有15例<Ⅲb，11例≥Ⅲb；8例有淋巴结转移，18例无淋巴结转移；7例低-中分化，19例中-高分化。所有患者术前均未接受化疗或放疗，并均有组织病理学确诊。所有宫颈癌及癌旁组织标本收集后立即储存至-80 ℃冰箱。

1.1.2试剂与仪器RNA提取试剂盒(天根生物公司)，miRNA逆转录试剂盒(诺维赞生物公司)，荧光定量PCR试剂盒康(世纪生物公司)，Biotek Epoch微量核酸定量仪购自美国Biotek公司，7500荧光定量PCR仪购自ABI 公司。

1.1.3RT-PCR引物设计miRNA-135b的引物序列通过PCR引物设计软件Primer Premier 5.0设计has-mir-135b和U6的引物序列，具体序列如下：has-mir-135b-5p：5′-CCTGGCTTTTCATTCCTATGTGA-3′，U6：5′-GCTTCGGC AGCACATATACTAAA-3′，并由In-vitrogen 公司合成。引物干粉离心后用DEPC水配制成20 μmol·L-1，置于-20 ℃冰箱备用。

1.2方法

1.2.1总RNA的提取和反转录从宫颈癌组织和癌旁组织中抽提总RNA，按RNA提取试剂盒说明书进行，采用定量分光光度法在A260/280处对提取RNA进行定量。按miRNA逆转录试剂盒说明书对样本总RNA进行反转录，反转录反应由1 μg的总RNA，与10 μL 2×RT mix，2 μL mix，1 μL oligo dNTPs,1 μL Random hexamers，总体系20 μL。 25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，经逆转录形成cDNA。

1.2.2RT-PCR检测miR-135b根据RT-PCR试剂盒说明书进行荧光定量PCR，以2-ΔΔCt表示基因的相对表达水平。实时PCR体系为 20 μL。10 μL 2×mix，2 μL primer，2 μL reverse primer，2 μL cDNA，4 μL H2O。 95 ℃的30 s，95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s，总共40个循环。PCR是一式三份。

2　结果

2.1宫颈癌及癌旁组织miR-135b表达应用RT-PCR检测26对配对的宫颈癌癌组织及癌旁组织中miR-135b的表达，通过配对样本t检验，宫颈癌癌组织中miR-135b的平均表达量(8.36±3.67)大于癌旁组织中miR-135b的平均表达量(6.19±2.81)，差异具有统计学意义(t=2.247，P=0.003)，见图1。

图1　miR-135b实时荧光定量PCR (t=2.247，P=0.003)

2.2miR-135b表达与临床病理特征肿瘤组织中miR-135b的表达水平与临床分期(P=0.029)和有无淋巴结转移(P=0.022)有相关性，即临床分期越差，有淋巴结转移时miR-135b表达水平越高，见表1。

表1　miR-135b表达与宫颈癌

3　讨论

宫颈癌在低收入和中等收入国家是女性最常见的癌症之一。在过去的一个世纪这些国家都在致力建立成功的筛查项目来显著降低宫颈癌的发病率和死亡率。这些筛查依赖细胞学巴氏涂片发现宫颈癌的前期病变。这些检查可以预防多达91%的浸润性宫颈癌[5]。然而，这些项目需要大量资金投入。因此，寻找更为客观精准的肿瘤标志物来标记宫颈癌发病和预后是重要的研究方向。miRNA可以结合到目标mRNA的3′UTR，调节mRNA的稳定和翻译，最终导致翻译抑制或目标mRNA被降解[6]。miRNA可分为致癌基因或抑癌基因，并参与细胞的多个生物过程，包括细胞增殖、凋亡、代谢、细胞分化[7]。miRNA的发现为肿瘤的研究提供了一个新的方向，也为探索宫颈癌新的生物标志物和其转移和发展机制提供了方向。miRNA参与多种癌症的转移和发展。到目前为止，除了mir-127[8]，很少有miRNAs被报道与宫颈癌的转移和进展有关。

miR-135b基因位于第l号染色体长臂第3区2号带的第1号亚带(1q32.1)，其在骨肉瘤[3]、结肠癌[4]、前列腺癌[8]等多种肿瘤中表达上升。在非小细胞肺癌中，miR-135b通过激活Hippo信号通路调控靶基因LZTS1，进而促进肺癌转移[9]。Arigoni等[10]发现在乳腺癌和前列腺癌细胞中miR-135b表达上调，并靶向雌激素受体、雄激素受体和缺氧诱导因子1α( hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α) ，进而促进肿瘤细胞的增殖。在小鼠头颈鳞癌细胞中，miR-135b促进肿瘤细胞的增殖、转移、克隆，并下调FIH的表达和HIF通路的活性，成为致癌miRNA[11]。

Valeri等[12]发现，miR-135b的过度表达触发了老鼠和人体抑癌基因APC的缺失，导致PTEN/PI3K通路的异常，癌基因SRC的表达上调并促进肿瘤的转化和进展。miR-135b的过度表达在与结直肠癌相关的炎症中是普遍事件，且与肿瘤分期及预后不良有密切关系。有研究认为粪便中的miR-135b，可作为结直肠癌及进展期腺瘤的非侵袭性的生物学标记物[13]。本研究采用荧光定量PCR实验对26例子宫内膜癌癌组织及癌旁组织进行定量分析，发现miR-135b在宫颈癌癌组织中的表达(8.36±3.67)高于癌旁组织(6.19±2.81)，差异具有统计学意义，表明miR-135b可能在宫颈癌的发生发展中起一定作用。而且，miR-135b的表达与宫颈癌淋巴结转移、临床分期之间存在显著的相关性(均P<0.05)。

总之，本研究表明miR-135b在宫颈癌癌组织中高表达，可能发挥着癌基因的作用，促进宫颈癌的增殖作用。并且miR-135b的表达与宫颈癌淋巴结转移、临床分期存在相关性。当然，由于样本量和样本来源的局限性，本研究结果有待于大样本研究进一步证实。

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Expression and Its Clinical Significance of miR-135b in Cervical Cancer

LIU Ping

(Second People′s Hospital of Nanyang,Nanyang 473000,China)

ObjectiveTo explore the expression of miR-135b in cervical cancer and adjacent tissues and its correlation with clinicopathologic characteristics of cervical cancer.Methods26 fresh cervical cancer tissues and its paired adjacent tissues were collected and detected by RT-PCR for expressions of miR-135b and its correlation with cervical cancer.ResultsThe expression of miR-135b was significantly up-regulated in cervical cancer tissues compared with the adjacent tissues ((8.36±3.67) VS (6.19±2.81),P<0.05).The significant correlation were found between miR-135b expression and clinicopathologic parameters,including lymph node metastasis and clinical stage (Ⅲb) of cervical cancer (all P<0.05).ConclusionThe miR-135b might play an important role in the carcinogenesis and development of cervical cancer.

cervical cancer；miR-135b；clinical stage；lymphnode metastasis

1672-688X(2016)03-0177-03DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.03.005

2016-06-15

南阳市第二人民医院，河南南阳 473000

刘平(1984-)，女，河南南阳人，医师，从事妇产科临床、科研工作。

R737.33,Q786

A