南海红树林内生真菌Sk-4代谢产物研究

杨建香

（桂林师范高等专科学校学报编辑部，广西桂林541001）

南海红树林内生真菌Sk-4代谢产物研究

杨建香

（桂林师范高等专科学校学报编辑部，广西桂林541001）

研究南海红树林内生真菌Sk-4的代谢产物。方法：采用硅胶柱色谱法、凝胶色谱法（Sephadex LH-20）、TLC（薄层层析法）等进行分离纯化，并通过氢谱、碳谱、质谱等数据分析鉴定化合物的结构。结果：分离出四个化合物从红树内生真菌的菌体中。经波谱解析，分别为：（1）大黄素-9，10-蒽二酮；（2）Curvularin；（3）5，5’-氧-二亚甲基-双（2-呋喃甲醛）；（4）3，8-二羟基-6-甲基-9-氧-9H-氧杂蒽-1-羧酸酯。结论：四个化合物均首次从南海红树林内生真菌Sk-4中分离得到。

红树林；内生真菌；代谢产物

人类生存的星球的75%的表面被海水覆盖，海洋是地球上生物资源最丰富的领域，也是万物的生命之源。特殊的海洋环境造就了海洋生物种类的特殊性。海洋生物的一个重要类群是海洋真菌，海洋真菌是一块具有极大开发潜力的新领域，可以孕育出种类繁多且结构特异的新型药理活性代谢产物。

海洋真菌中的红树林，由于特殊的生长环境，已经成为海内外专家寻找先导化合物的重要途径。红树林内生真菌更是构成了海洋真菌中非常重要的类群。［1］红树林内生真菌由于其独特的遗传背景和代谢途径使得其代谢产物呈现出化合物结构新颖、种类繁多、生物活性多样化的特点。［2］我国广州中山大学林永成课题组率先开展了红树林内生真菌次级代谢产物的研究，在新药的开发研究方面取得了非常重要的突破。

本文通过对南海红树林内生真菌SK-4的次级代谢产物进行系统的研究，结果首次从该红树林内生真菌的菌体中分离得到四个化合物，通过质谱、核磁波谱数据分析，鉴定出该化合物分别为：（1）大黄素－9，10-蒽二酮；（2）Curvularin；（3）5，5’-氧-二亚甲基-双（2-呋喃甲醛）；（4）3，8-二羟基-6-甲基-9-氧-9H-氧杂蒽-1-羧酸酯。

一、实验部分

（一）仪器和试剂

柱层析硅胶（300-400目）（青岛裕民源硅胶试剂厂生产），薄层层析硅胶（GF254）（青岛基亿达硅胶试剂有限公司生产）；柱层析反相硅胶Rp-C18（40-60μm）（上海博势生物科技有限公司生产），柱层析凝胶（Sephadex LH-20）（北京绿百草科技有限公司生产）。RE-52CS旋转蒸发仪（上海楚柏实验室设备有限公司生产）。Bruker-500核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司生产），Thermo DSQ电子轰击电离质谱仪（美国Thermo公司生产）。实验中所用的甲醇、石油醚、乙酸乙酯等均为分析纯试剂。

（二）菌种培养

红树林内生真菌SK-4采自广东省湛江市，采用土豆（土豆需要削皮，切碎）、大米、葡萄糖和酵母膏作为发酵培养基，首先在一个大型的圆口的塑料桶中量取普通自来水50升，然后用电子天平秤取土豆6（Kg）、大米5（（Kg）、葡萄糖10（Kg）和酵母膏1（Kg），分别加入水中，用木棒反复搅拌，并调节该溶液为中性。装250mL培养基于500mL的三角瓶内，然后在常压下灭菌35 min。

在紫外照射下杀菌30min后，开始接种45升，在恒温摇床上培养30天后开始收集培养液和菌体。

（三）提取与分离

将所得的培养液和菌体采用纱布过滤，在培养液中加入等体积的乙酸乙酯反复萃取，至少5次，上层萃取液浓缩成浸膏过柱。菌体晒干后，加入甲醇浸泡，至少浸泡5次，将所得的浸泡液浓缩，结果获得甲醇浓缩液30克。将获得的浓缩液中加入柱层析硅胶（300-400目）100克，进行反复多次柱层析分离，以石油醚：乙酸乙酯（10：90，20：80，30：70，40：60，50：50）梯度洗脱，薄层层析法多次分离。最终分离出四个化合物，并通过电子分析天平称量，获得化合物1（12.05mg），化合物2（5.05mg），化合物3（8.10mg）和化合物4（5.45mg）。并通过电子轰击质谱、核磁波谱数据等方法鉴定出化合物的结构。

（四）化合物的实验数据

化合物1：红色结晶，1HNMR（Acetone-d6，500MHz）：δ7.18（1H，d，1.4Hz），6.87（1H，d，2.6Hz），6.75（1H，d，1.4 Hz），6.30（1H，d，2.6Hz），2.12（3H，s），12.60（1H，s），12.10（1H，s），9.98（1H，s）；13CNMR（Acetone-d6，500MHz）：188.5（C），179.3（C），163.4（C），163.1（C），160.2（C），146.4（C），133.4（C），131.1（C），122.2（CH），118.3（CH），111.2（C），108.2（C），106.6（CH），105.7（CH），15.0（CH3）。

化合物2：无色结晶，1HNMR（CDCL3，400 MHz）：6.16（1 H，d，1.6 Hz），6.11（1 H，d，1.6 Hz），4.68（1 H，m），3.56（1 H，d，J=14.8 Hz），3.47（1 H，d，J=14.8 Hz），2.86（1 H，m），2.51（1 H，d，m），1.51（1 H，m），1.371 H，m），1.29（1 H，m），1.23（1 H，m），1.20（1 H，m），1.17（1 H，m），1.06（1 H，m），1.02（1 H，m），0.88（3 H，d，J=5.8 Hz），12.13（1 H，s），9.71（1 H，s）；13CNMR data（CDCL3，400 MHz）：202.5（C），171.7（C）160.8（C）159.0（C），137.7（C），122.0（CH），113.0（C），103.2（CH），73.3（CH），44.4（CH2），40.4（CH2），33.6（CH2），28.2（CH2），25.3（CH2），24.1（CH2），21.3（CH3）。

化合物3：白色粉末，1HNMR（CDCL3，400 MHz）：6.96（1H，d，J=7.5 Hz），6.28（1H，d，J=7.5 Hz），4.25（2H，s），8.95（1H，s）；13CNMR（CDCL3，400MHz）：δC180.2（CH），160.2（C），150.8（C），120.9（CH），116.5（CH），60.7（CH2）。EIMS：m/z 254。

化合物4：白色晶体，EIMS：m/z 300。1HNMR（CDCL3，400 MHz）：δH 6.85（1H，d，J=2.4Hz），6.76（1H，d，J=，2.4Hz），6.49（1H，d，J=2.4Hz），6.66（1H，d，J=2.4Hz），3.80（3H，s），2.30（3H，s），12.40（1H），10.30（1H）；13C NMR（CDCL3，400 MHz）：δC181.4（C），170.1（C），165.4（C），163.1（C），162.0（C），158.6（C），153.6（C），138.7（C），115.4（CH），115.0（CH），114.0（C），110.0（CH），109.0（C），106.1（CH），63.8（CH3），25.3（CH3）。

二、结果与讨论

化合物1：红色针状结晶，通过电子轰击质谱（EIMS）显示化合物的分子量为270，再结合核磁波谱以及DEPT谱推断出该化合物的分子式为C15H10O5，不饱和度为11。从1HNMR中可以看出该化合物有两个螯合的酚羟基（δ 12.60和12.10），说明这两个酚羟基与酮羰基形成分子内氢键，一个酚羟基（δ 9.98），另外δ 7.18（1H，d，1.4Hz）和6.75（1H，d，1.4 Hz）与δ 6.87（1H，d，2.6Hz）和δ 6.30（1H，d，2.6Hz），通过H的化学位移以及他们之间的偶尔常数，推断出这四个H属于苯环上的芳香H质子，且他们处于间位，δ2.12（3H，s）说明该化合物中存在一个甲基。13CNMR中，δ 188.5，179.3说明化合物中存在明显的两个酮羰基，再结合δ163.4（C），163.1（C），160.2（C），146.4（C），133.4（C），131.1（C），122.2（CH），118.3（CH），111.2（C），108.2（C），106.6（CH），105.7（CH）说明该化合物是一个典型的蒽醌类结构。通过与参考文献［3］对照，确定该化合物是大黄素－9，10-蒽二酮。

化合物2：无色的固体，电子轰击质谱（EIMS）显示出化合物的分子量为292，再结合1HNMR谱中显示化合物中有20个H信号、13CNMR谱显示该化合物有16个C信号，从而推断出该化合物的分子式为：C16H20O5，不饱和度为7；1HNMR谱显示出该化合物有两个酚羟基，其中一个是螯合的酚羟基δ12.13（1H，s），另一个为普通的酚羟基δ9.71（1H，s），δ6.16（1H，d，1.6 Hz））和6.11（1 H，d，J=1.6 Hz）显示是苯环上的氢，且通过耦合常数推断属于间位氢，13CNMR显示化合物中存在一个酮羰基（δ202.5），一个酯基（δ171.7），一个甲基（δ21.3），以及DEPT谱显示该化合物中有6个CH2，3个CH，6个季碳。结合1HNMR谱，δ4.68（1H，m），δ 3.56（1H，d，J=15.7 Hz）和3.47（1H，d，J=15.7 Hz），2.86（1H，m）和2.51（1H，d，m）；1.51（1H，m）和1.37（1H，m）；1.29（1H，m）和1.23（1H，m）；1.20（1H，m）和1.17（1H，m）；1.06（1H，m）和1.02（1H，m）；以及13CNMR谱，δ73.3（CH），δ 44.4（CH2），40.4（CH2），33.6（CH2），28.2（CH2），25.3（CH2），24.1（CH2）说明化合物中有一个大环内酯。将核磁数据与参考文献［4-5］对照，基本一致，所以推断该化合物为：Curvularin。

化合物3：白色结晶，通过质谱（EIMS）显示出该化合物的分子离子峰为234，推断出化合物的分子量为234，但是1HNMR谱显示化合物中有5个H，13CNMR谱中显示化合物有6个C，这样初步推断出该化合物为对称结构，化合物的分子式为：C12H10O5，不饱和度为8，DEPT谱显示化合物有2个季碳，3个CH，1个CH2。由于该化合物是对称结构，说明化合物中有4个季碳，6个CH，2个CH2。1HNMR谱中显示化合物中有一个醛基δH 8.95（1H，s），δ 6.96（1H，d，J= 7.5 Hz）和δ 6.28（1H，d，J=7.5 Hz）显示为烯氢，通过耦合常数推断为相邻的烯氢。另外有一个连有氧原子的亚甲基δ 4.25（2H，s）。再结合相关的13CNMR数据，δC180.2（CH），160.2（C），150.8（C），120.9（CH），116.5（CH），60.7（CH2）。推断出该化合物是一个醚类结构。根据上述波谱数据并与参考文献［6］对照，基本一致。

化和物4：白色固体，电子轰击质谱（EIMS）显示化合物的分子量为300，再根据1HNMR、13CNMR和DEPT谱推断出化合物的分子式为C16H12O6，不饱和度为11。1HNMR谱显示有两个酚羟基，其中一个为螯合的酚羟基（δH12.4），另一个普通的酚羟基（δH10.3），δ6.85（1H，d，J=2.4Hz）和6.76（1H，d，J=，2.4Hz）以及，6.66（1H，d，J=2.4Hz）和6.49（1H，d，J=2.4Hz），从氢质子的化学位移以及耦合常数推断出为苯环中的间位氢。且存在两个苯环。δ3.80（3H，s）和2.30（3H，s）显示化合物中存在两个甲基，且前一个甲基与氧原子相连。13CNMR谱中，显示化合物中存在一个酮羰基（δ181.4），一个酯基（δ170.1），通过以上数据的推断，得知化合物的不饱和度为10，而该化合物的不饱和度为11，说明存在一个环。根据上述数据，并与参考文献对照［7］，确定化合物为3，8-二羟基-6-甲基-9-氧-9H-氧杂蒽-1-羧酸酯。

［1］Sarma V V，Vittal B P R.Biodiversity of mangrove fungi on different substrata of Rhizophora apiculata and Avicennia spp．from Godavari and Krishna deltas，east coast of India［J］.Fungal Diverdity，2000（5）：23－41．

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［3］敏德，徐丽萍，张治针，等.天山大黄的化学成分研究［J］.中国中药杂志，1998，23（7）：416-418.

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Metabolites of Mangrove Endophytic Fungus Sk-2 from the South China Sea

Yang Jianxiang
（Editorial Department of Journal of Guilin Normal College，Guilin，Guangxi 541001，China）

Objective：To study the secondary metabolites of mangrove endophytic fungus No·Sk-4 from the south china sea.Method：The compounds were isolated by column chromatography and identified on the basis of physic-chemical constants and spectral analysis.Result：Four metabolites were obtained and elucidated as 1，3，8-trihydroxy-6-methyl-9，10-anthraquinone（1），Curvularin（2），5，5'-oxydimethylene-bis（2-fur-aldehyde）（3），3，8-dihydroxy-6-methyl-9-oxo-9H-xanthene-1-carboxylate（4）.Conclusion：The four metabolites were obtained from endophytic fungus No·Sk-4 for the first time.

mangrove；endophytic fungus；metabolites

O629

A

1001-7070（2016）03-0137-03

（责任编辑：韦国友）

2016-03-05

广西教育厅科研项目“三种中国南海红树林内生真菌次级代谢产物研究”（项目编号：KY2015LX598）。

杨建香（1979-），女，山西原平人，桂林师范高等专科学校教授、博士，主要从事天然产物化学研究。