宫颈癌发生发展过程中组织微小RNA-21表达及高危型HPV病毒载量变化的意义

王彬



·论著·

宫颈癌发生发展过程中组织微小RNA-21表达及高危型HPV病毒载量变化的意义

王彬

目的研究宫颈癌发生发展过程中组织微小RNA-21表达及高危型HPV病毒载量变化的意义。方法选取2011年3月至2015年3月收治的宫颈病变并行宫颈活检的患者150例，CINⅠ组(n=39)、CINⅡ组(n=37)、CINⅢ组(n=34)，CC组 (n=40)，分析miR-21的表达及HR-HPV载量与宫颈癌临床病理特征的联系，miR-21的表达与HR-HPV载量的相关性，不同宫颈病变中miR-21的表达及HR-HPV载量。结果宫颈癌患者肿瘤细胞低分化者miR-21表达(6.12±0.83)低于中分化者(8.17±0.65)及高分化者(11.54±1.29)(P<0.05)；肿瘤细胞直径>4 cm者HR-HPV载量(26.53±3.12)高于<4 cm者(23.60±2.85)(P<0.05)，FIGO分期Ⅰ～ⅡA者HR-HPV载量(23.86±2.34)低于ⅡB～Ⅳ者(27.59±3.12)；宫颈癌HR-HPV阳性者miR-21表达(9.75±0.83)高于HR-HPV阴性者(5.47±0.46)，差异有统计学意义(P<0.05)；但miR-21表达及HR-HPV载量与宫颈癌年龄、FIGO分期、病理类型、淋巴转移、脉管浸润无明显相关性(P>0.05)；CINⅠ组HR-HPV阳性患者(41.03%)分别低于CINⅡ组(67.57%)、CINⅢ组(85.29%)及CC组(92.50%)，CINⅠ组mi-R21相对表达水平(6.42±0.53)低于CINⅡ组(7.26±0.61)、CINⅢ组(8.24±0.65)及CC组(9.36±0.70)，差异有统计学意义(P<0.05)。结论微小RNA-21表达可反应宫颈癌细胞分化程度，高危型HPV病毒载量可反应宫颈癌FIGO分期及肿瘤直径范围，微小RNA-21表达与高危型HPV病毒载量呈正相关，联合检查微小RNA-21及高危型病毒载量能够提示宫颈癌前病变、宫颈癌的发生发展。

相关性；微小RNA-21；高危型HPV病毒载量变化；宫颈癌

宫颈癌是女性发病率最高的恶性肿瘤。性生活紊乱、早婚、早育、多次分娩可增加宫颈癌的发病率。宫颈癌早期症状不明显，病情进展到一定程度可有阴道异常流血、白带增多等症状。由宫颈癌前病变进展为宫颈癌的时间很长，因此尽早发现宫颈癌前病变与有效的阻断治疗能够显著降低宫颈癌的发病率[1]。人类乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)特异性极高，容易感染于机体表皮及黏膜鳞状上皮，可分为高危型与低危型。高危型人类乳头状瘤病毒(high-risk human papilloma virus,HR-HPV)感染是宫颈癌的主要致病因素。但有学者报道，宫颈癌患者可有HR-HPV阴性表达，表明宫颈癌尚有其他致病因素[2]。微小核糖甘酸(small ribose monophosphate,miRNA)是一种内源性非编码RNA小分子，稳定性强。miRNA可作为原癌基因或者抑癌基因，miR-21是典型的原癌基因，几乎所有癌症的发生、发展都有miR-21表达。本报告旨在研究组织微小RNA-21表达、高危型HPV病毒载量与宫颈癌发生、发展的相关性。报告如下。

1　资料与方法

1.1一般资料选取我院2011年3月至2015年3月收治的宫颈病变并行宫颈活检患者150例：纳入标准[3]：(1)年龄35～55岁；(2)有性生活史且无子宫切除；(3)细胞学检查异常或HPV检查阳性者。排除：(1)已接受宫颈治疗的患者；(2)其他恶性肿瘤、免疫性疾病、严重感染等其他合并疾病。所有患者填写知情同意书。其中CINⅠ组(宫颈上皮内瘤样病变Ⅰ级)39例、CINⅡ组(鳞状上皮中度非典型增生Ⅱ级)37例、CINⅢ组(鳞状上皮重度非典型增生Ⅲ级)34例，CC组 (子宫颈癌包括宫颈鳞癌和宫颈腺癌)40例。

1.2方法

1.2.1miR-21的检测：①宫颈细胞病理学诊断：收集患者宫颈组织样本，予以10%的甲醛织样本，依次用80%、90%、95%及100%的乙醇浸泡2 h,将石蜡溶解充分包埋组织样本，切片，常规染色、封片，镜检，并区分组织样本；②实时荧光定量PCR检测HPV DNA：进行HPV16/18病毒的DNA检测，试剂盒由公司提供；③提取HPV mRNA：组织样本置于液氮中研磨，转移至玻璃匀浆器内，滴入1 ml的RNAiso Plus进行匀浆，再移至1号1.5 ml的离心管内，充分混合均匀后置于-5℃环境中孵育5 min，高速离心5 min，将上清液移至2号1.5 ml离心管内，加入0.2 ml的氯仿，混合均匀后置于-5℃环境中孵育5 min，高速离心10 min，取上清液移至3号1.5 ml离心管内，加入0.5 ml的异丙醇，混合均匀，置于-5℃环境中孵育5 min，高速离心5 min，去除上清液，添加1 ml的75%乙醇，混合均匀，高速离心5 min，去除上清液，常温放置10 min，添加10 μl 的DEPC处理水使RNA溶解。取2 μl的RNA置于胶体电泳中并拍照，予以紫外分光光度计(赛业生物科技有限公司)检测OD值，依据OD值计算RNA的浓度，调整RNA浓度为100 ng/μl并置于-70℃保存。④HPV mRNA反转录实时荧光定量PCR检测：A逆转录：加入1 μg的RNA样本混合20 μl反应体系，加入样品， 42℃环境中反应60 min，99℃环境中反应5 min后终止反应，4℃环境中冷却后于-20℃保存。B荧光定量PCR：委托天津普瑞塞而生物科技公司设计合成Genebank GDB HPV16/18 的序列引物、荧光探针与标准品，将标本低温离心10 s，置于TC988C-2 荧光PCR 扩增仪(重庆美德生物科技有限公司)内进行 PCR 反应，单个反应的升降温度设置为20℃/s，单个循环设置为62℃/s处行荧光检测。

1.2.2HR-HPV载量检测：要求患者取样前3 d禁止使用阴道栓塞类药物，前1 d禁止同房，非经期。第二代杂交捕获技术检测HR-HPV的载量，组织样本DNA双链释放并分解为单链RNA，RNA与DNA单链组合探针形成杂交体，予以特异性抗体捕获杂交体，并固定于微孔壁内，加入含碱性磷酸酶的第二抗体同DNA-RNA杂交体结合，添加底物显色，读取碱性磷酸酶含量，确定DNA-RNA杂交体含量。HR-HPV载量由样本的相对光单位与标准阳性对照之比(RLU/PC)来衡量，载量1.00为阴性，载量≥1.00为阳性。

1.3观察指标分析miR-21的表达及HR-HPV载量与宫颈癌临床病理特征的联系，miR-21的表达与HR-HPV载量的相关性，不同宫颈病变中miR-21的表达及HR-HPV载量。

2　结果

2.1分析miR-21的表达与宫颈癌临床病理特征的联系miR-21的表达与宫颈癌年龄、FIGO分期、肿瘤直径、病理类型、淋巴转移、脉管浸润无明显的相关性(P>0.05)；miR-21的表达与宫颈癌细胞分化程度密切相关(P<0.05)。见表1。

2.2分析HR-HPV载量与宫颈癌临床病理特征的联系HR-HPV载量与宫颈癌年龄、FIGO分期、病理类型、淋巴转移、脉管浸润无明显相关性(P>0.05)；HR-HPV载量与宫颈癌分期、肿瘤直径密切相关(P<0.05)。见表2。

表1　miR-21的表达与宫颈癌临床病理特征的联系　±s

表2　HR-HPV载量与宫颈癌临床病理特征的联系　±s

2.3分析宫颈癌患者HR-HPV载量与mi-R21表达的相关性宫颈癌HR-HPV阳性者miR-21表达水平低于HR-HPV阴性者(P<0.05)，可见HR-HPV载量与mi-R21表达呈正相关。见表3。

表3宫颈癌患者HR-HPV载量与mi-R21表达的相关性

HR-HPVmi-R21表达阳性(n=28)9.75±0.83阴性(n=12)5.47±0.46 r值0.6151 P值0.0024

2.4分析不同宫颈癌病变中HR-HPV载量与mi-R21的表达CINⅠ组HR-HPV阳性患者分别低于CINⅡ组、CINⅢ组及CC组，CINⅠ组HR-HPV阴性患者分别高于CINⅡ组、CINⅢ组及CC组，差异有统计学意义(P<0.05)；CINⅠ组mi-R21表达水平低于CINⅡ组、CINⅢ组及CC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4　不同宫颈癌病变中HR-HPV载量与mi-R21的表达

3　讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，我国宫颈癌的发生率和死亡率占全球1/3，而且临床发现子宫颈癌患者具有年轻化的趋势[4]。宫颈癌的发生是1个多因素、多阶段的渐进生物学过程，及时有效的诊断与治疗是宫颈癌的治疗宗旨。研究报道，癌前病变与宫颈癌的首要致病因素为HPV感染，这是一种常见的下生殖道感染，但并不是所有HPV感染都会发展为宫颈癌，通常按照诱发宫颈癌的风险可以分为高危型与低危型[5]。HR-HPV的长期或反复感染是宫颈黏膜细胞发生异常增殖和病变的原因之一，大量临床研究表示宫颈病变严重程度与HR-HPV病毒载量表现为正相关[6]。但研究者表示鳞状细胞癌发病早期，HPV16的病毒载量极低，因此关于HPV病毒载量与宫颈癌的联系需要进一步临床研究证实[7]。研究认为可以通过评估微小RNA的表达情况预测HPV感染的结果，miRNA的表达有助于区分高危型HPV感染后不同的宫颈病变[8]。

miRNA是一种小分子RNA，其主要通过碱基互补与靶mRNA的3'端非翻译区结合，导致靶mRNA降解或抑制蛋白质的合成，从而在转录或转录后水平影响靶基因的表达。抑癌基因或原癌基因的miRNA种类较多，miRNA 表达谱所显示的生物学信息在肿瘤的发生和发展中扮演着重要的角色，能够准确预测肿瘤的发生、发展，可作为肿瘤标志物应用于临床[9]。miRNA中与宫颈癌关系密切，miR-21是一种致癌基因，其在众多肿瘤细胞中均有异常表达，宫颈癌发生与发展中miR-21起重要作用[10]。Let-7是一种miRNA，通过转录后的调控机制，可以特异性结合到信使RNA，从而降解靶基因mRNA或抑制其翻译；STAT3能调节多种基因的活性，从而参与肿瘤的发生、发展和细胞凋亡；人乳头状瘤病毒癌蛋白E6可以调控Let-7、STAT3及miRNA的表达[11,12]。研究表示病毒HPV阳性细胞E6/E7癌基因表达与胞内和外来体穿梭miRNA的表达是互相促进的[13,14]。HPV16的癌基因可以调控miR-21的表达，因此miR-21可以作为治疗宫颈癌及其癌前病变的分子靶点。

本研究结果显示，宫颈癌患者肿瘤细胞低分化者miR-21表达低于中分化者及高分化者，肿瘤细胞直径≥4 cm者HR-HPV载量高于<4 cm者，宫颈癌HR-HPV阳性者miR-21表达水平低于HR-HPV阴性者，但miR-21表达及HR-HPV载量与宫颈癌年龄、FIGO分期Ⅰ～ⅡA者HR-HPV载量低于ⅡB～Ⅳ者、病理类型、淋巴转移、脉管浸润无明显相关性；CINⅠ组HR-HPV阴性患者分别高于CINⅡ组、CINⅢ组及CC组，CINⅠ组mi-R21表达水平低于CINⅡ组、CINⅢ组及CC组，由此可见，miR-21表达及HR-HPV载量与宫颈癌的危险性呈正相关，可作为临床上常规筛查宫颈癌的动态监测手段。综上所述，了解miR-21与高危HPV载量变化在宫颈癌发生、发展中的作用可以完善宫颈癌的病因学和分子病理学理论、发现新的早期诊断与预后的生物标志物、达到宫颈癌预防与治疗的目的，具有广阔的应用前景。

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Significance of the expression of small RNA-21 and the changes of high-risk HPV viral load in the pathogenesis and development of cervical cancer

WANGBin.

DepartmentofGynaecologyandObstetrics,LuohuDistrictHospitalforMaternalandChildHealth,Guangdong,Shenzhen518000,China

ObjectiveTo investigate the significance of the expression of small RNA-21 (miR-21) and the changes of high-risk HPV viral load in the pathogenesis and development of cervical cancer.MethodsOne hundred and fifty patients with cervical lesion who were admitted and treated in our hospital from March 2011 to March 2015 were enrolled in the study,and all the patients underwent cervical biopsy.These patients were divided into CINⅠgroup (n=39),CINⅡ group (n=37),CIN Ⅲ group (n=34), CC group (n=40).The expression levels of miR-21 and HR-HPV load in different types of cervical lesions were detected.The correlation between the expressins of miR-21 and HR-HPV load was analyzed,moreover, the correlation between the expressins of miR-21 as well as HR-HPV load and clinicopathological charateristics of cervical cancer was analyzed.ResultsThe expression levels of miR-21 in patients with poorly differentiated tumor cells (6.12±0.83) were significantly higher than those (8.17±0.65) in patients with moderately differentiated tumor cells and those (11.54±1.29) in patients with well differentiated tumor cells (P<0.05). The HR-HPV load (26.53±3.12) in patients with tumor diameter >4cm was significantly higher than that (23.60±2.85) of patients with tumor diameter <4cm (P<0.05).The HR-HPV load (23.86±2.34) in patients at FIGO staging Ⅰ～ⅡA was obviously lower than that (27.59±3.12) in patients at FIGO staging ⅡB～Ⅳ. The expression levels of miR-21 in HR-HPV-positive patients (9.75±0.83) were significantly higher than those (5.47±0.46) in HR-HPV-negative patients (P<0.05). However there were no significant differences in the expression levels of miR-21,HR-HPV load, patient's age, FIGO staging,pathological types, lymphatic metastasis and vessel infiltration (P>0.05).The percentage (41.03%) of HR-HPV-positive patients (41.03%) in CINⅠgroup (41.03%) was significantly lower that that in CINⅡ group (67.57%), CIN Ⅲ group (85.29%), CC group (92.50%), moreover, the relative expression levels of mi-R21 in CINⅠgroup (6.42±0.53) was significantly lower than that in CINⅡ group (7.26±0.61),CIN Ⅲ group (8.24±0.65) and CC group (9.36±0.70) (P<0.05).ConclusionThe expression levels of miR-21 can reflect the differentiation degree of cervical cancer cells,and high-risk HPV viral load can reflect FIGO stages of cervical cancer and diameter range of cancer,moreover,the expression of miR-21 is positively correlated to high risk HPV viral load.The combined detection of miR-21 with high risk viral load can suggest cervical precancerous lesions, the pathogenesis and development of cervical cancer.【Key words】correlation; small RNA-21;high-risk HPV viral load; cervical cancer

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.20.004

518000广东省深圳市罗湖区妇幼保健院妇产科

R 737.33

A

1002-7386(2016)20-3059-04

2016-01-15)

项目来源：深圳市罗湖区科技创新局[编号：罗科(2015)26号]