熊去氧胆酸对家兔保胆取石术后胆囊胆汁成分和胆囊组织中VIP和Calponin表达的影响

王　威，石　鑫，陈　虎，苗伏龙，秦琦瑜，陈进军

(河北医科大学第一医院肝胆外科，河北 石家庄 050031)



·论著·

熊去氧胆酸对家兔保胆取石术后胆囊胆汁成分和胆囊组织中VIP和Calponin表达的影响

王威，石鑫，陈虎，苗伏龙，秦琦瑜，陈进军

(河北医科大学第一医院肝胆外科，河北 石家庄 050031)

目的探讨熊去氧胆酸胶囊联合保胆取石术对胆囊结石家兔模型术后胆汁成分及胆囊组织中血管活性肠肽(vasoactine intrestinal peptide，VIP)和调宁蛋白(calponin，Cap)表达的影响。方法选择雄性新西兰家兔60只作为研究对象，建立胆囊结石模型后进行保胆取石术，根据术后处理方式不同分为3组，对照组给予普通饮食，模型组给予致石饮食，干预组给予致石饮食+熊去氧胆酸。检测3组家兔血清中脂质含量、胆汁中总胆固醇(total cholesterol，TC)和总胆酸(total bile acid,TBA)含量，以及胆囊组织中VIP和Cap的表达量。结果干预5周后，模型组家兔血清中三酰甘油(triglyceride，TG)、TC、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量均高于对照组(P<0.05)；干预组家兔血清中TG、TC、LDL-C含量均低于模型组(P<0.05)；模型组家兔胆汁中TC含量高于对照组(P<0.05)；干预组胆汁中TC低于模型组(P<0.05)但高于对照组；干预组家兔胆汁中TBA含量高于模型组及对照组(P<0.05)；模型组家兔胆囊组织中VIP、Cap含量高于对照组(P<0.05)；干预组家兔胆囊组织中VIP和Cap蛋白含量低于模型组(P<0.05)。结论熊去氧胆酸胶囊干预能够调节胆囊结石家兔模型保胆取石术后的胆汁成分，减少胆道舒张物质VIP和Cap的表达。

胆囊结石病；胆囊造口术；熊去氧胆酸

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.09.006

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of ursodeoxycholic acid combined with gallbladder protected lithotomy on postoperative bile composition and muscle composition in rabbit model of gallbladder stones. MethodsSixty male New Zealand rabbits were chosen as research subjects, endoscopic gallbladder protected lithotomy were conducted after gallstones model were made, randomly divided into three groups according to postoperative treatment, the control group received normal diet, the model group received lithogenic diet, the intervention group received lithogenic diet+ursodeoxycholic acid. Then serum lipid contents, bile total cholesterol(TC) and total bile acid(TBA), calponin(Cap) and vasoactine intrestinal peptide(VIP) expression in biliary smooth muscle were detected. ResultsAfter five weeks of intervention, serum triglyceride(TG), TC, low density lipoprotein cholesterol(LDL-C) contents in model group rabbits were higher than that in the control group(P<0.05). Serum TG, TC, LDL-Cl contents in intervention group were lower than that in model group(P<0.05). Bile TC contents model group rabbits were higher than that in the control group(P<0.05); bile TC contents in intervention group were lower than that in the model group and were highter than that in the control group (P<0.05); bile TBA contents in intervention group were higher than that in the control group and the model group (P<0.05) . VIP and Cap in model group gallbladder tissue were higher than that in the control group(P<0.05). VIP and Cap in intervention group gallbladder tissue were lower than that in the model group(P<0.05).ConclusionUrsodeoxycholic acid capsule interventions can regulate bile components and reduce expression of Cap and VIP in rabbit model of gallbladder stones received gallbladder protected lithotomy.

十几年前，国内学者张宝善[1]提出了保胆取石术，该手术的优势是既避免了对胆管及周围器官的医源性损伤，又减轻了手术给患者带来的痛苦，术后恢复快。但是保胆取石术后存在胆囊结石复发的风险，如何预防胆囊结石形成和复发是临床面临的重要课题。熊去氧胆酸是由多个羟基组成的有机化合物，具有促进内源性胆汁酸分泌、拮抗疏水性胆汁酸的作用，可达到预防结石形成的目的[2]。国内学者从胆囊运动功能、预防复发展开研究。本研究通过建立胆囊结石家兔模型，分析熊去氧胆酸胶囊联合保胆取石术对胆囊结石家兔模型术后胆汁成分及胆囊组织中血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、调宁蛋白(calponin,Cap)表达的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物由河北省实验动物中心提供雄性新西兰家兔60只(合格证号：2014-0008)，3～4月龄，体质量1 800～2 200 g，随机分为对照组、模型组和干预组各20只，各组家兔年龄、体质量差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

本次研究报经医院动物伦理委员会批准。

1.2主要药物、仪器与试剂①致石饮食：高总胆固醇(total cholesterol，TC)饲料(1.2%的TC，98.8%的普通饲料)由河北省实验动物中心提供；熊去氧胆酸：上海三维长江生化制药厂，国药准字H31021950，规格50 mg×60片。②仪器：日本日立公司7600型全自动生化分析仪；美国通用公司LOGIQ9型动物用便携式B超；美国Beckman公司J-30I高速冷冻离心机；美国Pharmacia Biotech公司紫外光栅分光光度计；美国Nicolet公司Mgna FIIR-750型红外光谱仪；美国Bio-Rad公司Power PAC300电泳仪与Power PAC电转仪；上海浦江分析仪器厂ML-902定量恒温磁力搅拌器。③试剂： ECL蛋白免疫印迹检测试剂购自Amersham公司；苯甲基磺酸氟购自上海申能博彩有限公司，VIP、Cap抗体购自武汉博士生物工程有限公司。

1.3实验方法

1.3.1家兔胆囊结石模型建立健康成年雄性家兔60只，室温23 ℃左右予以致石饮食喂养5周。

1.3.2分组实施干预根据Juniper制定的标准划分，把生成不同等级的胆固醇结晶级胆囊结石的家兔平均分配到各组中，并予以不同的干预，对照组给予普通饮食，模型组给予致石饮食，干预组给予致石饮食+熊去氧胆酸。各组家兔均1 d分2次灌胃。

1.3.3内镜下保胆取石术3%戊巴比妥钠静脉麻醉(30 mg/kg)。无菌操作。上腹正中切口进腹，注射器抽净胆汁后，5-0尼龙无损伤针线于胆囊底做一直径4 mm的荷包缝合切口，反复探查取净胆囊内结石，拉紧缝线结扎。生理盐水清洗后，关腹。

1.3.4胆固醇结晶及结石的观测取新鲜胆汁滴在载玻片上偏振光显微镜下观察胆固醇结晶。 打开胆囊直接肉眼观察,若胆汁内存在成形、粗大颗粒者定为结石。

1.4观察指标

1.4.1血脂测定干预后3周和5周时，经耳缘静脉采血，应用全自动生化分析仪测定三酰甘油(triglyceride，TG)、TC、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)含量。

1.4.2胆汁测定干预后5周时，均禁食水12 h后，3%戊巴比妥钠静脉麻醉(30 mg/kg)，而后将兔仰卧位固定于兔台上，局部脱毛，打开腹腔后分离胆囊，采集胆汁并应用全自动生化分析仪测定TC、总胆汁酸(total bile acid,TBA)含量。

1.4.3胆囊运动相关分子蛋白表达取胆囊组织100 mg，加入1 mL细胞裂解液(radio-immunopreci pitation assay， RIPA)与10 μL苯甲基磺酰氟(phenyl methane sulfonyl fluoride,PMSF)提取总蛋白15 μg，10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)电泳后，转移到硝酸纤维素膜。室温温育1 h，加入VIP、Cap蛋白抗体，37 ℃温育1～2 h，辣根过氧化物酶联试剂37 ℃温育1 h。PSB溶液洗涤，增强化学发光法显影，X线处记录影像。置于图像扫描仪下扫描，应用自带分析软件分析光密度。

1.5统计学方法应用SPSS 21.0软件进行数据分析，计量资料比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1各组血清中脂质成分含量比较干预5周后，模型组家兔血清中TG、TC、LDL-C含量均明显高于对照组(P<0.05)；干预组血清中TG、TC、LDL-C含量均低于模型组，但仍高于对照组(P<0.05)。见表1。

2.2各组胆汁中TC、TBA和胆囊组织中VIP、Cap含量比较干预5周后，模型组家兔胆汁中TC含量明显高于对照组，干预组明显低于模型组，但仍高于对照组(P<0.05)；干预5周后，模型组TBA含量与对照组差异无统计学意义(P>0.05)；干预组家兔胆汁中TBA含量均明显高于模型组和对照组(P<0.05)；模型组家兔胆囊组织中VIP和Cap表达量高于对照组(P<0.05)；干预组家兔胆囊组织中VIP和Cap表达量低于模型组，但仍高于对照组(P<0.05)。见表2。

表13组家兔干预5周后血清脂质含量比较

组别TGTCLDL-C对照组2.49±0.273.60±0.411.55±0.17模型组5.69±0.62*7.94±0.91*3.85±0.42*干预组3.15±0.39*#4.92±0.55*#2.01±0.22*#F13.28211.39214.482P0.0000.0000.000

*P<0.05与对照组比较#P<0.05与模型组比较(SNK-q检验)

表23组家兔干预5周后胆汁中TC、TBA含量和胆囊组织中VIP、Cap比较

组别胆汁TC(mmol/L)TBA(μmol/L)胆囊组织VIP(%)Cap蛋白(%)对照组3.49±0.405.24±0.59100.00±12.89100.00±13.57模型组7.41±0.79*5.02±0.52254.68±30.15*287.58±34.22*干预组4.02±0.47*#9.44±1.03*#134.22±15.47*#140.18±16.22*#F9.17510.33815.86614.492P0.0000.0000.0000.000

*P<0.05与对照组比较#P<0.05与模型组比较(SNK-q检验)

3　讨　　论

我国胆囊结石发病率为10%左右，是一种常见病、多发病。1882年，Langenouch所创胆囊切除术治疗胆囊结石延续至今，近20多年，腹腔镜胆囊切除术曾一度被尊为胆囊结石治疗的“金标准”[1]。但随着胆囊切除术的推广以及在临床中的大量应用，越来越多的学者认识到该手术方式存在一定的弊端，如胆囊切除术有可能造成胆汁反流性胃炎、消化不良胆囊切除术后综合征，并有可能增加术后结肠癌的发生率[3-5]。胆囊切除术后的并发症有黄疽、出血、胆漏、急性腹膜炎、急性胰腺炎、结石残余等，若处理不当,后果严重,甚至危及生命[6]。胆囊切除术造成胆管损伤占0.18%～2.3%，病死率占0.17%[7]，其带来的后遗症也是灾难性的。近10余年来，在我国蓬勃兴起的胆囊取石术(即通常称谓的“保胆取石术”)已对传统的胆囊切除术提出了严峻挑战。但保胆取石术后存在一定结石复发问题[8]。胆囊结石的形成机制是遗传、环境、饮食、基因、脂类代谢等多因素共同作用的结果。而保胆取石并未去除形成结石的因素，未阻断形成结石的机制[9-10]。尽管如此，内镜下保胆取石术确实存在诸多方面的优点，正在逐步为外科医师所接受。因此，如何预防保胆取石术后胆囊结石的复发成为了临床研究的热点。

胆固醇结石是胆囊结石最主要的类型，其形成机制是胆汁内TC含量过高、TC与TBA比例失调、胆道动力学异常等[7]。胆汁中TC浓度过饱和是胆囊胆固醇结石形成的最主要的生理变化[11]。而胆汁中TC成分的增加会增加胆囊平滑肌细胞膜的TC含量和TC/磷脂比率，使磷脂的脂肪酰链形成空间巨大的运动阻碍。胞膜会增厚、僵硬，可引起膜蛋白功能的破坏，从而影响胆囊平滑肌的收缩功能[12]。熊去氧胆酸也称3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，口服后能够迅速在空肠与回肠前部被动转运吸收，于回肠末端主动转运吸收，半衰期为3.5～5.8 d。通过抑制TC在肠道内的吸收与降低TC向胆汁分泌，可使胆囊结石溶解[13]。动物实验表明，借助熊去氧胆酸亲水性、无细胞毒性以及对细胞的保护作用，替代亲脂性、去污剂样毒性胆汁酸，且具有免疫调节、保护肝细胞膜的作用[14]。熊去氧胆酸能够增加胆汁酸的分泌，可利胆、抑制肝脏TC的合成、减少肠道TC的吸收、增加TC转换为胆汁酸、使胆汁中TC减少。本研究结果显示，干预5周后，模型组家兔血清中TC以及胆汁中TG、TC、LDL-C含量均高于对照组，说明在胆石症的发生过程中，胆汁和血清中的脂质成分发生改变；干预组胆汁中TC含量以及血清中TG、TC、LDL-C含量均明显低于模型组，但仍高于对照组；干预组胆汁中TBA含量均高于对照组和模型组。国内外学者也有类似的文献报道[3，15]。提示熊去氧胆酸干预能够降低血脂含量以及胆汁中TC含量，促进内源性胆汁酸分泌，并抑制其重吸收，从而调节胆汁中TC和TBA的比例，进而预防胆囊结石的形成。

胆囊是贮存和浓缩胆汁的器官，能够进行节律性和紧张性收缩，胆囊的活动以及Oddi括约肌的活动相互配合和协调。Oddi括约肌收缩时胆囊舒张，胆汁进入胆囊并贮存；Oddi括约肌舒张时胆囊收缩，胆汁进入肠道[16]。VIP和Cap是调节Oddi括约肌以及胆囊收缩和舒张状态的两类物质。VIP和Cap能够抑制平滑肌的收缩并使平滑肌处于舒张状态。当VIP和Cap合成和分泌增多时，胆囊处于舒张状态，胆汁无法及时排出并大量蓄积，该状态长期存在会导致胆囊结石的形成[17-18]。本研究模型组家兔胆囊组织中VIP和Cap表达高于对照组；干预组家兔胆囊组织中VIP和Cap表达低于模型组,但仍高于对照组。与沈阳等[19]文献报道基本相似。说明胆石症的发生与VIP和Cap的高表达有关，熊去氧胆酸有助于降低VIP和Cap的高表达。

综上所述，熊去氧胆酸胶囊干预能够调节胆囊结石家兔模型保胆取石术后的胆汁成分，减少胆道舒张物质VIP和Cap的表达，可预防保胆取石术后胆囊结石复发。因本研究可供参考的文献较少，且没有对术后胆囊结石复发情况进行比较分析，可能会影响到结果的准确性，有待于今后开展更多基础和临床研究加以求证。

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(本文编辑：许卓文)

Effect of ursodeoxycholic acid combined with gallbladder protected lithotomy on postoperative bile composition and expression of Calponin and VIP in biliary smooth muscles

WANG Wei, SHI Xin, CHEN Hu, MIAO Fu-long, QIN Qi-yu, CHEN Jin-jun

(Department of Liver and Gallbladder surgery, the First Hospital of Hebei Medical university,Shijiazhuang 050031, China)

cholecystolithiasis; cholecystostomy; ursodeoxycholic acid

2016-01-21；

2016-04-06

王威(1981-)，男，河北石家庄人，河北医科大学第

R735.7

A

1007-3205(2016)09-1014-04

一医院主治医师，医学硕士，从事肝胆外科疾病诊治研究。