利用重组枯草芽孢杆菌生产γ舶被丁酸的研究

张六六 毛连山

摘要[目的]构建一株高产L谷氨酸脱羧酶的重组枯芽孢杆菌B.subtilis 168/pHT01gadApdxH。[方法]以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为宿主细胞，将大肠杆菌脱羧酶基因（gadA）与其辅酶磷酸吡哆醛的再生基因（pdxH）在质粒pHT01上串联表达，构建一株高产L谷氨酸脱羧酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis 168/pHT01gadApdxH。[结果]带有pdxH基因的重组菌B.subtilis 168/pHT01gadApdxH催化谷氨酸生成γ氨基丁酸（GABA）的效率明显高于B.subtilis 168/pHT01gadA。催化反应24 h时，生成的GABA浓度达252 g/L，较对照菌株提高了61 g/L。进一步对重组菌B.subtilis 168/pHT01gadApdxH全细胞转化谷氨酸生成GABA的条件进行了优化，其最优条件：转化缓冲液为pH 5.0的0.1 mol/L TrisHCl，转化温度40 ℃，激活剂为5 mmol/L Ca2+与5 mmol/L Mg2+。在上述最优条件下，催化24 h生成的GABA浓度达327 g/L。[结论]所获得的重组菌转化效率较高，具有一定的工业化应用前景。

关键词 枯草芽孢杆菌；L谷氨酸脫羧酶；磷酸吡哆醛的再生；L谷氨酸；γ氨基丁酸

中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）09-171-03

Abstract[Objective]The aim was to construct a recombinant B.subtilis 168/pHT01gadApdxH for producing high yield of Lglutamate decarboxylase.[Method]The gadA and pdxH gene from E.coli was cloned to the plasmid pHT01， resulted in the two recombinant plasmids pHT01gadA and pHT01 gadApdxH， and then separately transformed to Bacillus subtilis 168.[Result]The recombinant B.subtilis 168/pHT01gadApdxH can produce 252 g/L γaminobutyric acid （GABA） after catalytic reaction 24 h， compared with the B.subtilis 168/pHT01gadA increased by about 61 g/L. The whole cell transformation glutamate to GABA conditions were optimized， and the optimum conditions were 0.1 mol/L TrisHCl pH 5.0 buffer， 40 ℃， 5 mmol/L Ca2+ and 5 mmol/L Mg2+. Under optimum conditions， the GABA concentration reached 327 g/L by the recombinant B.subtilis 168/pHT01gadApdxH.[Conclusion]The obtained recombinant bacteria has higher transformation efficiency， with a certain industrialization prospect.

Key words Bacillus subtilis； Lglutamate decarboxylase； Regeneration of pyridoxal phosphate； L glutamic acid； γ aminobutyric acid

γ氨基丁酸（GABA）是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，在日本和美国等国家已被广泛应用于食品、医药、化妆品和畜牧行业中[1-2]。2009年9月27日，国家卫生部第十二号公告已批准GABA为新资源食品，其相关保健制品也在国内保健品市场上快速成长。目前，国内GABA的生产方法主要有化学合成法、分离提取法和生物发酵法。化学法生产的GABA不能用于食品行业，而分离提取法生产GABA受到技术和原材料的限制，虽然可以小规模产业化生产，但价格一直高居不下，限制了其应用[3]。

发酵法生产GABA主要是通过谷氨酸脱羧酶对谷氨酸脱羧而生成，其转化过程需要磷酸吡哆醛作为其辅酶。发酵法生产GABA的菌株主要有大肠杆菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、红曲和霉葡萄汁酵母等[4-6]。乳酸菌、红曲和霉葡萄汁酵母等野生菌株的转化率均较低，虽然大肠杆菌转化效率较高，但生产过程抗生素的添加及后处理过程中内毒素的出去限制了其应用。莫征杰等[7]尝试运用安全的宿主细胞枯草芽孢杆菌转化GABA，但由于枯草芽孢杆菌中无磷酸吡哆醛的再生途径使得转化效率较低。

笔者采用枯草芽孢杆菌为宿主细胞，基于基因工程手段将大肠杆菌脱羧酶基因（gadA）与其辅酶磷酸吡哆醛的再生基因（pdxH）在质粒pHT01上串联，构建重组菌枯草芽孢杆菌宿主菌B.subtilis 168/pHT01gadApdxH，通过增加辅酶磷酸吡哆醛的量而加强菌株对谷氨酸的转化效率，并对其催化过程进行了优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和主要试剂。

所构建的重组枯草芽孢杆菌为江苏纳克生物工程有限公司自主研发和构建的工程菌，枯草芽孢杆菌宿主菌Bacillus Subtillis 168、大肠杆菌DH5α、表达载体pHT01均由江苏纳克生物工程有限公司保藏。

细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、限制性内切酶BamHI、XbaI和XmaI、T4连接酶、氨苄青霉素、氯霉素、IPTG、xgal、pUCmT载体等均购自上海生工生物工程有限公司。其余试剂为国产分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。引物合成和重组质粒的测序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.1.2 培养基。①液体LB 培养基：蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L。

②固体LB 培养基：在液体LB 中加入1.5%（W/V）的琼脂粉。

③发酵培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，硫酸铵2.5 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 重组枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建。

1.2.1.1 大肠杆菌gadA和pdxH基因的克隆。

采用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取大肠杆菌DH5α基因组DNA。以该基因组DNA为模板，P1（GGATCCATGGACCAGAAGCTGTTAACGGA）和P2（TCTAGATTATCAGGTGTGTTTAAAGCTGT）为引物，PCR扩增gadA基因，以引物P3（TCTAGACCAATTAAAGGAGGAAGGATCAATGTCTGATAACGACGA AT TGCA）和P4（CCCGGGTTATCAGGGTGCAAGACGATCA）为引物扩增pdxH基因。利用PCR产物回收试剂盒，纯化PCR扩增产物gadA基因片段和pdxH基因片段。将纯化PCR产物与pUCmT载体连接，连接反应产物转化大肠杆菌DH5α。涂布蓝白斑筛选平板，选取平板上的白色菌落，提取其中的质粒进行双酶切鉴定，筛选得到重组菌DH5α/pUCmTgadA和DH5α/pUCmTpdxH。提取质粒，送上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.1.2 表达载体pHT01gadA和pHT01gadApdxH的构建。

采用BamHI和XbaI双酶切质粒pUCmTgadA和pHT01，回收gadA基因片段和pHT01片段，T4連接酶连接回收的片段，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组菌DH5α/pHT01gadA，送上海生工生物工程有限公司进行测序验证。

采用XbaI和XmaI双酶切质粒pUCmTpdxH和pHT01gadA，回收pdxH基因片段和pHT01gadA片段，T4连接酶连接回收的片段，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组菌DH5α/pHT01gadApdxH，送上海生工生物工程有限公司进行测序验证。

1.2.1.3 枯草芽孢杆菌B.subtilis 168的转化。

参照Zhang[8]的两步法，将重组质粒pHT01gadA和pHT01gadApdxH分别转化B.subtilis 168。

1.2.1.4 工程菌B.subtilis/pHT01gadA和B.subtilis 168/pHT01gadApdxH的表达。

将工程菌B.subtilis/pHT01gadA、B.subtilis 168/pHT01gadApdxH和B.subtilis 168/pHT01分别接种至发酵培养基中，于37 ℃、200 r/min下振摇培养至对数中期，加入终浓度1 mmol/L IPTG诱导6 h，离心收集菌体，测定gadA的酶活。同时取等量的菌体进行工程菌的催化过程分析，考察B.subtilis/pHT01gadA和B.subtilis 168/pHT01gadApdxH催化性能的差异。

1.2.2 gadA酶活测定。

取0.5 mL发酵液，10 000 r/min离心5 min，去上清液，加0.2 mol/L的谷氨酸溶液（pH 4.6）10 mL，于37 ℃恒温水浴中，200 r/min振荡反应10 min后，立即沸水浴10 min终止反应，10 000 r/min离心5 min，收集上清液；取1.0 mL上清液于三角瓶中，加入39.0 mL蒸馏水，混匀，吸取1.0 mL于带塞试管中，加入1 mL质量分数6%的苯酚和0.4 mL次氯酸钠（活性氯质量分数≥5.2%），充分混匀，沸水浴10 min后冰水浴20 min，再加入3.1 mL蒸馏水，然后于630 nm处测定吸光度；制作GABA含量与吸光度的标准曲线，根据标准曲线和所测吸光度，计算酶活。酶活力单位定义：在反应液中，1 min催化底物生成1 μmol GABA所需的酶量为1个活力单位（U）。

1.2.3 重组枯草芽孢杆菌的催化过程优化。

将重组菌B.subtilis 168/pHT01gadApdxH接种至发酵培养基中，于37 ℃、220 r/min下培养24～30 h，至gadA酶活不再增加，8 000 r/min离心收集菌体备用。

1.2.3.1 催化反应体系缓冲液。

分别用pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的0.1 mol/L TrisHCl及0.1 mol/L磷酸盐缓冲液悬浮菌体至体积与离心前发酵液体积相等，考察其对谷氨酸转化的影响。

1.2.3.2 催化反应温度。

将pH 7.0的0.1 mol/L TrisHCl催化反应体系分别在25、30、35、40、45 ℃下进行谷氨酸转化试验，考察其对谷氨酸转化的影响。

1.2.3.3 金属离子。

在pH 7.0的0.1 mol/L TrisHCl催化反应体系中分别加入Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+等离子，考察其对谷氨酸转化的影响。