响应面分析法优化大枣多糖的提取工艺

天津医科大学总医院（300052）陈丽佳

天士力制药集团股份有限公司（300402）丛德刚 杨文静

大枣为鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus）植物枣（Ziziphus jujubaMill.）的干燥成熟果实，为常用中药之一，《神农本草经》列为上品。味甘，性温，归脾、胃经。为补中益气、养血安神、缓和药性的常用中药，用于脾虚食少、乏力便溏、妇人脏躁等，可药食两用[1]。《中国药典》2010年版规定，大枣为鼠李科植物枣Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果实。具有补中益气、养血安神等功效[2]。其主要的成分为多糖类物质，本研究以多糖为考察指标，运用响应面分析（Response surface analysis, RSA）法对大枣中的提取条件进行优化，采用Design-expert 8.0.6软件进行实验设计及数据分析，确定最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 材料 沧州金丝小枣

1.2 仪器 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器有限公司)；754紫外-可见分光光度计(天津市普瑞斯仪器有限公司)；CP225D型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；鼓风式干燥箱(天津天宇实验仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线制作 (1)对照品溶液的配制。①蒽酮溶液的配置：准确称取1.0000mg的蒽酮，定容于50ml乙酸乙酯中，配成蒽酮试剂。蒽酮试剂需要现用现配。②标准溶液的配制：精密称取100℃恒温干燥至恒重的葡糖糖50mg，定容于100ml容量瓶中，摇匀，即制成对照品溶液，待用。

(2)线性关系的考察 葡萄糖（Glu）标准曲线：分别吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml，定容于50ml容量瓶中，摇匀待用。将上述溶液分别取1ml，然后加入2ml浓硫酸，再加入0.5ml新配制的蒽酮溶液（冰浴），摇匀，沸水浴10min。加热时用封口膜将试管口封住，防治水分的挥发。加热结束后自来水冷却，室温放置10min，于620nm下测定吸光度。空白对照为未加葡萄糖溶液的纯净水。以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，Y=0.0074x-0.0514（R=0.9982），线性范围为10～70μg/ml。

1.3.2 样品溶液的制备 精密称取已干燥的去核大枣粉末2g，置于圆底烧瓶中，加入一定倍量蒸馏水回流提取3次，每次1h，将提取液浓缩，浓缩后定容于25ml容量瓶中，待用。

精密吸取制备的样品溶液1ml，按照标准曲线的测定方法测定吸光度后，计算样品的多糖含量。

附表 响应面实验因素与水平

1.3.3 大枣多糖最佳提取条件的确定 在前期单因素实验的基础上，选取加水倍量、提取时间、提取次数三个因素，采用Box-Behnken响应面设计对大枣多糖的提取条件进行优化，采用通过Design-expert 8.0.6软件进行实验设计和数据分析，确定大枣多糖的最佳提取条件。

2 结果与讨论

2.1 响应面分析因素水平的选取 根据前期单因素实验的结果，选取加水倍量、提取时间、提取次数三个因素，设计三因素三水平的响应面分析方法，实验因素与水平设计见附表。

2.2 模型的验证性实验 为检验模型的可靠性，在上述条件下进行大枣多糖的提取试验，得到大枣多糖的提取率为220.59mg/g（n=3），与理论预测值相差不大，认为回归方程与实际情况拟合较好、验证了模型的准确性。

3 结论

该研究经响应面法优化，得到大枣多糖的提取条件为加水倍量37倍、提取时间2.2h、提取次数2次，在该工艺条件下进行提取实验，大枣多糖的含量与预测值偏差为0.6%。Box-Behnken实验设计建立了各因素对多糖提取影响的二次多项式模型，并利用统计学方法对改模型进行了显著性检验，得到最佳值。