高通量测序技术在航天大曲微生物多样性中的应用

周　森，胡佳音，赵卫鹏，刘红霞，于晓涛，魏金旺

（北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京101301）

高通量测序技术在航天大曲微生物多样性中的应用

周森，胡佳音，赵卫鹏，刘红霞，于晓涛，魏金旺

（北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京101301）

太空搭载微生物已有多年历史，因太空具有超真空、超洁净、微重力、强辐射的特殊环境，可以引起染色体变异，导致表达性状改变。牛栏山酒厂利用太空搭载技术将“牛栏山一号清香型低温大曲”搭载神舟9号飞船，在太空遨游13 d，利用太空失重状态以及太空射线等因素对酒曲微生物进行诱导，采用免培养手段“高通量测序技术”对太空大曲和对照大曲进行微生物多样性分析。结果表明，大曲在航天飞行过程中，由于受到宇宙射线、高真空、弱磁场等多种环境因素的影响，改变了原有大曲中微生物的比例。

航天大曲； 对照大曲； 高通量测序

高通量测序技术是传统测序技术一次革命性的改变，被称为下一代测序技术，可以一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，为环境样品中微生物群落的多样性研究提供了契机。通过对环境样品DNA进行大规模测序，可以得到涵盖微生物群落中全部微生物的遗传信息，从而获得微生物群落组成。指导传统微生物分离，获得可靠的活体菌株，对筛选性状突变菌起到指导作用。本研究采用高通量测序技术，从分子生物学层面全面解析“牛栏山一号清香型低温大曲”在经过太空遨游后的微生物比例关系，为太空大曲的微生物分离以及优势菌株筛选提供理论支撑。

1　材料与方法

1.1材料

牛栏山一号清香型低温航天大曲，简称航天大曲；牛栏山清香型低温大曲，简称对照大曲。

1.2主要仪器与试剂

德国Eppendorf公司1-14k高速冷冻离心机；美国BIORAD公司基础型水平电泳仪；美国BIORAD公司全自动凝胶成像仪；美国MP FastPrep-24样品快速制备系统。

1.3实验方法

1.3.1高质量DNA提取方法

称取1 g混匀大曲样品，用Fastprep处理后，采用土壤基因组DNA提取试剂盒（FastDNA SPIN Kit for Soil）提取并检验浓度（每个样品提取3份DNA，确保DNA浓度）。

1.3.2高通量测序

通过Illumina平台（Miseq）进行Paired-end测序，测定真菌ITS1区和细菌16S V3—V4区，下机数据经过预处理，去除低质量reads（过滤标准：Q20≥90%）。之后用QIIME软件进行总体分析，利用软件将序列相似性大于97%的定位为一个OTU（operational taxonomic units）。选取分析数据中每个OTU中一个有代表性的序列，通过进行blast比对，获得每一个OTU种名。

2　结果与分析

2.1DNA提取

将提取完成后的DNA进行电泳检测，Maker采用D2000检验（图1）。

图1　DNA提取电泳图

通过图1可以看出，航天大曲和对照大曲DNA样品质量较好，在15000BP处都出现明显条带。

2.2真菌高通量结果

航天大曲和对照大曲本次高通量测序共获得124种真菌OTU，将数量在0.1%以上OTU进行种名对比，其余OTU归纳为其他。

图2　航天大曲真菌多样性

图3　对照大曲真菌多样性

由图2、图3和表1可以看出，航天大曲和对照大曲的真菌微生物主体种类改变不大，但各种微生物所占比例有所变化。同对照大曲相比，航天大曲中的毕赤酵母（P.kudriavzevii）、异常维克汉姆酵母（W.anomalus）、发酵毕赤酵母（P.fermentans）、伞枝横梗霉（L.corymbifera）、谢瓦散囊菌（E.chevalieri）所占比例均减少，而扣囊复膜酵母（S.fibuligera）所占比例增加，并且酿酒酵母（S.cerevisiae）和多变跟毛霉（R.variabilis）在航天大曲中并未检测出。说明，在太空飞行过程中，大曲中真菌受外界宇宙射线、高真空、弱磁场等环境影响出现衰亡现象，不同的衰亡率造成了大曲真菌微生物比例的改变。

表1　对照大曲和航天大曲主要真菌OTU比例对比

2.3细菌高通量结果

航天大曲和对照大曲本次高通量测序共获得666种细菌OTU，将数量在1%以上OTU进行种名对比，其余OTU归纳为其他。

图4　航天大曲细菌多样性

图5　对照大曲细菌多样性

表2　对照大曲和航天大曲主要细菌OTU比例对比

通过以上高通量数据（图4、图5和表2）可以看出，大曲在经历太空飞行后，细菌种类并未出现大的变化，比例组成变化较大。同对照大曲相比，比例减少较多的主要有融合维斯氏菌（W.confusa）、弯曲乳杆菌（L.curvatus）、柠檬明串珠菌（L.citreum）、戊糖片球菌（P.pentosaceus）；比例增多的主要有地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、耐酸乳杆菌（L.acetotolerans）。说明太空中的独特环境同样影响了大曲中细菌的存活率，不同种微生物的死亡数量改变了航天大曲中细菌的比例组成。

2.4结果分析

大曲中的真菌和细菌在经历过太空飞行后，由于太空中的宇宙射线、微重力、高真空、弱磁场等独特环境，均出现了衰亡现象，而不同种微生物的衰亡数量引起了航天大曲的微生物比例组成发生变化。

在真菌方面，对照大曲的主体是扣囊复膜酵母占90%，余下的丝状真菌和酵母所占比例不大，在经历太空飞行后，由于毕赤酵母、异常维克汉姆酵母、伞枝横梗霉等出现大量衰亡，而扣囊复膜酵母未出现衰亡或者衰亡量较少，造成扣囊复膜酵母所占比例从90%增加到96%。

在细菌方面，对照大曲主要由芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和乳酸菌、融合维斯氏菌、柠檬明串珠菌、戊糖片球菌组成，占细菌总数的66%。在经历太空飞行后，多数乳酸菌所占的比例减少，而地衣芽孢杆菌比例由23%增加到40%，成为了航天大曲中的主体细菌。

3　讨论

通过高通量实验结果可以看出，大曲中的真菌和细菌在航天飞行过程中由于受到宇宙射线、高真空、弱磁场等环境因素的影响，均出现了不同程度的死亡，改变了原有大曲中微生物的比例。通过高通量测序技术，解析了经历太空飞行后大曲在与对照大曲之间的微生物种类组成及相应的比例关系，对太空大曲的微生物分离起到指导作用。依据高通量测序数据，我们可以有目的地设计培养基，对航天大曲和对照大曲中微生物进行分离鉴定。并且可以将微生物分离结果同高通量数据相互印证，从而获得准确结果及活体菌株，为下一步的太空诱变微生物的性能测定、筛选以及特色航天酒的生产打下坚实的基础。

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Application of High-Throughput Sequencing in the Analysis of Microbial Diversity of Space Mutation Daque

ZHOU Sen，HU Jiayin，ZHAO Weipeng，LIU Hongxia，YU Xiaotao and WEI Jinwang
（Niulanshan Distillery，Beijing SunxinAgriculture Co.Ltd.，Beijing 101301，China）

Space flight microbial experiment has a long history.Outer space has special environment（ultra-vacuum，ultra-clean，micro-gravity，and intense radiation）which might induce chromosome variation and further result in the change of microbial character expressions.Niulanshan No.1 Qingxiang low-temperature Daqu was once used for space flight experiment（in Shenzhou-9 spaceship and in outer space for 13 d）. In the conditions of weightless environment and intense radiation etc.，high-throughput sequencing was applied to analyze Daqu microbial diversity.Then the analytic results were compared with that of the contrast Daqu.And the results suggested that，microbial proportions in Daqu changed in outer space due to the influence of space environment.（Trans.by YUE Yang）

space mutation Daqu；contrast Daqu；high-throughput sequencing

TS261.1；Q93-3；TQ925.7

A

1001-9286（2016）09-0076-03

10.13746/j.njkj.2016122

2016-04-11

周森（1986-），男，工程师，大学本科，研究方向为白酒酿造微生物。

魏金旺。

优先数字出版时间：2016-06-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160603.1610.005.html。