复合生物制剂在浓香型白酒黄水酯化中的应用

张　丹，陈雪玲，付　瑜，胡先强，王　涛，游　玲

（1.宜宾学院，生命科学与食品工程学院，固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾644000； 2.宜宾职业技术学院，四川宜宾644003）

复合生物制剂在浓香型白酒黄水酯化中的应用

张丹1，陈雪玲2，付瑜1，胡先强1，王涛1，游玲1

（1.宜宾学院，生命科学与食品工程学院，固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾644000； 2.宜宾职业技术学院，四川宜宾644003）

为探讨一种自制酯化生香生物制剂在不同黄水酯化中的应用效果，对宜宾、泸州两地5家企业139口浓香型白酒窖池所产黄水进行窖外酯化，分别检测酯化前后黄水中主要有机酸、酯含量变化，发现不同企业黄水理化指标及酸、酯含量差异明显且呈现明显的企业特性；所有黄水酯化后丁酸乙酯及己酸乙酯含量均大幅上升，但乙酸乙酯、乳酸乙酯含量变化很小，己酸促进黄水酯化的效果显著，但各种酯的增加量与对应有机酸的原有含量或消耗量之间均无明确关联。研究结果揭示了黄水中主要有机酸酯化的部分规律，并从统计学角度确证了酯化生香制剂用于黄水窖外发酵生香效果，为后续用于生产提供依据。

浓香型白酒； 黄水； 酯化； 生物制剂

黄水是浓香型白酒窖内发酵过程中产生的液态副产物，其中不仅含有丰富的醇、醛、酸和酯类等浓香型白酒风味（前体）物质，还含有丰富的淀粉、还原糖、酵母自溶物等营养物质及大量经长期驯化的酿造微生物［1］。浓香型白酒发酵是开放式接种的多菌种固态发酵，每批次产品的发酵原料组分、微生物群落及工艺均存在差异，使得不同企业乃至窖池的黄水在理化指标方面存在差异，但行业尚未对此开展较为系统的研究。

目前，黄水主要用于人工窖泥生产、养窖护窖以及利用其中丰富的风味（前体）物质提高原酒品质或生产新型白酒［2］。其中，采用各种技术手段，高效利用其中丰富的风味（前体）物质，是行业应用最广的一类方式，如早期直接将黄水添加至蒸酒的底锅水中，利用“串蒸”方式使部分风味物质进入酒体，后由于传统串蒸效率低下，行业着重从提高黄水中风味物质含量及提取获得风味物质技术及装备方面开展了大量工作［3］。虽然添加己酸、乙酸等可以直接化学酯化［4-5］，但化学酯化反应条件较为苛刻，因此实际的做法是，添加窖泥、酒尾、曲粉等发酵1～2个月［6-7］，在此基础上，陈帅［8-9］、罗惠波［10］、刘宾［11］、刘子红［12］等先后利用红曲霉或酵母制成的各种酯化酶粗酶制剂对黄水进行酯化，使黄水中的酯含量大幅上升，用于底锅串蒸取得了很好的效果。

上述方案均涉及到酯化菌或酯化酶制剂的使用，但均存在各种各样的问题，如酯化周期过长，酯化效果不稳定，酯化后主要酯类物质比例失调等，且由于黄水理化组成的复杂性和波动性，现有研究未系统开展酯化影响因素及条件的研究，导致现有的市售酯化酶制剂在不同企业的应用效果很不稳定，影响了这一技术的推广应用。

在前期研究中，从宜宾浓香型白酒产区分离到1株高产酯化酶的红曲霉菌，以及1株产酯生香的酵母，组成混合菌剂接种到麸皮中培养，得到了一种包括微生物、酶及大量风味物质前体在内的黄水窖外发酵用生物制剂，初步应用发现其酯化力强，在不改变浓香型白酒原有风味特征的前提下，可大幅提升黄水酯含量，为探讨黄水理化指标波动对酯化效果的影响，收集了宜宾、泸州地区5家白酒企业的数百个黄水样品，使用该生物制剂酯化，希望找到不同企业不同窖池黄水酯化的规律，也为该生物制剂的应用提供技术支撑。

1　材料与方法

1.1生物制剂

酯化生香生物制剂：由本实验室保存的1株红曲霉菌及1株毕赤氏酵母加入麸皮混合培养、烘干而成。

1.2黄水

来自宜宾、泸州浓香型白酒产区5家规模以上浓香型白酒生产企业，分别编号为H、J、T、L、X的139个黄水样品，每个样品3个重复。泸州135个，宜宾312个，酯化前后黄水均12000 r/min离心10 min，0.22 μm过滤后备用。

1.3酯化方案

在250 mL三角瓶中，将200 mL黄水、2 mL己酸、10 g酯化生香生物制剂充分混匀，35℃保温酯化5 d后，与未酯化的200 mL黄水分别添加100 mL蒸馏水，于200 mbar下，80℃蒸馏出200 mL蒸馏液，备用。

1.4检测指标

静置澄清的黄水采用手持糖度计测定可溶性固形物含量，采用滴定法［13］测定酸度，采用电导仪测定电导率，采用pH计测定pH值。蒸馏液采用密度折光仪（梅特勒DM40-RX40）测定其乙醇含量。

采用气相色谱法测定蒸馏液中4种酯及离心过滤后黄水中乙酸、丁酸、己酸含量［14］，采用C18柱（5 μm，250× 4.6 mm），通过液相色谱法检测黄水中乳酸含量［15］：流动相：甲醇∶0.01 mol/L（NH4）2HPO4缓冲溶液pH2.8（3∶97，v/v），柱温28℃，流速0.7 mL/min，波长215 nm。使用纯度90%的L-乳酸（sigma）作为标样。

所得数据采用SPSS 19.0进行显著性分析。

2　结果与分析

2.1不同企业黄水主要酸酯含量差异

黄水是微生物在糟醅中混菌发酵，并通过糟醅渗滤而汇聚在窖池底部的混合产物，其中包括了几乎所有的白酒风味物质，分析黄水成分可在很大程度上揭示窖池内微生物的代谢状况。对来自宜宾的4家浓香型白酒企业（分别编号为H、J、T、X）及泸州1家白酒企业（编号L）的447个黄水样品（泸州135个，宜宾312个）进行了比较分析，发现两地黄水的理化性质及主体风味物质含量存在差异。

从理化指标来看（图1），不同企业黄水pH值差异很小，且方差很小，表明不同企业以及同一企业不同窖池的黄水pH值都很接近，这是因为窖池内发酵产物主要是乙酸、己酸、乳酸等弱酸，具有较好缓冲能力，这也为白酒窖池内各种生化反应的进行提供了一个稳定的酸碱体系。但H企业黄水酸度明显大于其他企业，可能是由于H企业发酵周期超过120 d，窖池内产酸细菌在发酵后期的厌氧环境中产酸较多。

图1　不同企业黄水主要理化指标

黄水中可溶性固形物及乙醇含量反映了糖化、发酵的深度，从图1可以看出，各企业黄水这两个指标虽有差异，但不显著，可见窖龄、发酵时间等因素对发酵深度无显著影响。值得注意的是，电导率直接反映了黄水中导电离子的浓度，间接反映了体系中束缚这些导电离子物质的含量，即黄水中有机质、腐殖质等具有缓冲能力的物质越多，游离的导电离子越少，T企业黄水电导率显著高于H、J、X 3个企业，可能是由于T企业多数窖池生产历史较短，窖池内可用于螯合导电离子的缓冲物质较少。

从图2、图3可以看出，由于不同生产工艺及生产历史，各企业黄水中主要酸、酯含量有明显差异。H、T企业黄水中总酯含量较高，主要是由于这2个企业发酵周期较长，都在120 d左右；L企业黄水总酯含量低于其他4个企业，可能是由于L企业多数窖池发酵时间较短，主要通过长周期发酵的“翻沙”窖池产酯，因此L企业窖池黄水酯含量的差异（方差）也较大；H、J、T、X企业窖池黄水中乙酸、乳酸含量较高的，其对应的酯含量也较高，而L企业黄水中的乙酸、己酸、乳酸含量均较高，但其对应酯含量并不高，特别是乳酸乙酯含量还显著低于H、J、X企业，表明L企业发酵过程中，有机酸的酯化不如其他企业充分，造成这种差异的主要原因仍是L企业窖池发酵周期较短，而多数浓香型白酒企业在生产上也有通过延长发酵时间提高酯含量；对于发酵周期超过70 d的企业来说，H、T企业黄水中的乙酸乙酯含量高于J、X企业，与这些企业黄水中乙酸含量的差异大致吻合，且4个企业不同窖池黄水中己酸、乳酸含量高的，其己酸乙酯、乳酸乙酯含量也相对较高，表明在长时间酯化的情况下，乙酸、己酸、乳酸与对应酯的生成关联度较大，但丁酸乙酯与丁酸含量没有显示出明显对应关系，表明发酵过程中丁酸可能不是影响丁酸乙酯生成的主要因素。

图2　不同企业黄水中4种有机酸含量

图3　不同企业黄水中4种酯含量差异

从各企业不同窖池黄水酯含量差异（方差）来看，生产历史较短的T企业样品间主要酯含量差异均最大，J、X企业不同窖池黄水中的丁酸乙酯含量相互间差异超过100%（方差大于平均值），而X企业不同窖池黄水中的丁酸差异很小，表明除丁酸外，还存在影响丁酸乙酯生成的重要因素。L企业不同窖池黄水中的己酸乙酯含量相互差异也超过100%，则可能是由于部分样品来自“翻沙”窖池，而发酵周期长、生产历史也在20年以上的H企业窖池黄水中己酸乙酯含量低于T企业正常发酵70 d的新窖池，似乎说明己酸乙酯的生成并不像传统认为那样主要依赖于老窖长时间发酵。

2.2酯化对黄水酸酯含量的影响

根据上述分析结果，在各黄水样品中加入富含酯化酶的复合生物制剂，以及1%己酸，35℃保温酯化120 h后检测黄水中主要酸、酯含量，发现乙酸乙酯、乳酸乙酯含量变化不显著，但丁酸乙酯、己酸乙酯均有大幅提升（图4），乙酸乙酯、乳酸乙酯并未明显增加，可能是由于在窖内发酵过程中，乙酸、乳酸已经达到满足其酯化平衡的最大酯化量，在这种情况下，增加酯化酶很难使对应酯含量增加，计算发现，不同窖池黄水中乙酸的酯化率在2.33%～4.64%之间，而乳酸的酯化率在42.5%～70.4%，造成不同窖池2种酸酯化率波动的因素还包括其他有机酸浓度、温度、酯化菌等，但一定程度上可以认为多数窖池内的酯化条件足以满足黄水中乙酸、乳酸的酯化需求。

图4　酯化对黄水中4种酯含量的影响

对己酸乙酯、丁酸乙酯而言，在外加93 mg/10 mL己酸后，大幅增加了己酸乙酯、丁酸乙酯生成，其中己酸乙酯酯化率由0.33%～1.0%变为0.19%～0.82%，略有下降，但己酸乙酯含量大幅上升，以T企业为例，扣除酯化后增加的己酸及酯化成己酸乙酯的己酸（28 mg/10 mL左右），仍有大部分己酸通过挥发损失或进入其他代谢途径，如分解为乙酸和丁酸，丁酸又进一步酯化生成丁酸乙酯，导致丁酸乙酯上升幅度甚至超过了己酸乙酯，这也是T企业黄水中乙酸、丁酸、丁酸乙酯含量均上升的原因，但其他企业黄水酯化后丁酸乙酯含量显著增加，而乙酸、丁酸并未明显增加，以H企业为例，酯化前后黄水中丁酸的降低量显然少于新增含量丁酸乙酯所需丁酸，表明丁酸另有重要来源，很可能就是来自于己酸的分解。

同时，己酸的分解也可能导致乙酸含量上升，如酯化后H、L、T企业黄水中乙酸含量明显上升（图5），但其乙酸乙酯含量反而略有降低，这可能是由于添加的酯化生香制剂及己酸改变了黄水中原有酯化平衡体系，使乙酸的酯化朝酯分解方向进行。另一方面，H、J、L、T、X企业的丁酸乙酯含量分别提高了119.2倍、64.8倍、730.1倍、41.8倍、242.9倍，己酸乙酯含量分别提高了3.0倍、0.8倍、1.3倍、3.5倍、4.4倍，其提高幅度的差异远远超过了各企业丁酸、己酸的含量差异，表明外加酯化酶及己酸放大了黄水本身丁酸乙酯、己酸乙酯含量的差异，且放大的幅度与黄水中丁酸、己酸的含量没有直接联系，表明酯化生香制剂对黄水中酯化反应体系的影响非常复杂，黄水窖外发酵需在预实验的基础上谨慎开展。

图5　酯化对黄水中乙酸、丁酸、己酸含量的影响

2.3窖龄对黄水酯化效果的影响

老窖池的黄水风味物质种类更丰富，酯类物质含量也较高，为探讨窖龄对酯化效果的影响，研究分析了3个企业窖龄从1年到100年的窖池黄水酯化前后的酸、酯含量变化差异（图6—图8）。从图6可以看出，对T企业而言，随着窖龄的延长，7年以内窖池黄水中的己酸乙酯、乳酸乙酯呈下降趋势，但窖龄超过30年，二者均明显增加，添加酯化生香制剂窖外发酵后，不同窖龄窖池黄水中各种酯的含量差异（方差）也大致维持了酯化前的水平，同时，老窖池黄水中主要有机酸、酯含量相互差异比新窖池小，酯化后仍然如此，表明酯化不能改变新老窖池黄水的差异。

图6　T企业1年、2年、7年及32年窖池黄水中主要有机酸酯化差异

图7　H企业10年、20年及30年窖池黄水中主要有机酸酯化差异

图8　L企业30年及100年窖池黄水中主要有机酸酯化差异

从图7、图8可以看出，对H企业10年、20年、30年窖池黄水及L企业30年、100年窖池黄水来说，随着窖龄增加，不同窖池黄水中乳酸乙酯含量均略有增加，但酯化后乳酸乙酯、乙酸乙酯含量均有所下降，且老窖池黄水下降幅度更大，且老窖池黄水酯化后异味感也更轻，推测可能是由于在黄水中乙酸、乳酸过量的情况下，在酯化生香制剂及己酸的影响下，成分更为复杂的老窖池黄水可与酯化制剂中的风味物质共同作用，使少量乙酸乙酯、乳酸乙酯经其他代谢途径转化，减少了单一组分带来的缺陷味感，酯化后的黄水风味也更自然。

3　结论与讨论

黄水的酯化、串蒸一直是广泛用于白酒生产的产酯生香方法，相关研究成果也较多。从黄水酯化方式来看，陈帅等添加红曲酶及酵母酯化［9］，罗惠波等添加酵母和酯化酶酯化［10］，刘子红直接添加红曲菌酯化［12］，使总酯含量增加7倍以上［9］，己酸乙酯含量最高增加了20倍［12］，上述酯化反应时间最短为20 d以上［9］，有的长达50 d［12］，而本研究使用的自制酯化生香制剂加入黄水中酯化5 d即可取得很好的酯化效果，且仅需添加1%己酸及4%乙醇或8%酒尾，酯化后的黄水仍保持了原有风味，同时，通过对多个企业多个窖池黄水的酯化确证了其酯化效果，并初步得到以下结论：①不同企业黄水采用酯化生香制剂酯化后，其丁酸乙酯及己酸乙酯含量大幅上升，但乙酸乙酯、乳酸乙酯含量变化不大或略有降低；②己酸促进酯化效果显著，但黄水中影响酯化效果的因素除酯化酶、有机酸外，尚有其他未知的重要因素，导致各种酯的增加量与对应有机酸的原有含量或消耗量之间均无关联；③酯化不能明显改变新、老窖池黄水差异，但老窖池黄水酯化后风味更自然。

总体上，虽然不同企业不同窖龄窖池黄水酯化效果略有差异，但这种差异更多来源于黄水本身，采用酯化生香生物制剂处理黄水前，可通过分析黄水中的酸、酯含量，据此设计较适宜的酯化方案（酯化生香生物制剂添加量、己酸添加量等），再通过预实验进行验证、优化，最终用于生产，可使酯化生香制剂起到最好的酯化效果。

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Application of a Compound Biological Agent in the Esterification of Yellow Water of Nongxiang Baijiu

ZHANG Dan1，CHEN Xueling2，FU Yu1，HU Xianqiang1，WANG Tao1and YOU Ling1
（1.College of Life Science and Food Engineering，Yibin University，Yibin，Sichuan 644000；2.Yibin Vocational and Technical College，Yibin，Sichuan 644003，China）

In order to evaluate the application effects of a self-made biological agent in the esterification of different yellow water，it was used in out-pit esterification of yellow water from 139 Nongxiang Baijiu pits of 5 distilleries in Luzhou/Yibin.The change in main organic acids content and esters content in yellow water before and after the esterification were detected respectively.There was significant difference in physiochemical indexes，esters content，and acids content of yellow water from different distilleries and such difference represented evident enterprise characteristics.After the esterification，the content of ethyl butyrate and ethyl caproate in yellow water increased greatly，while the content of ethyl acetate and ethyl lactate changed little.Caproate acid promoted the esterification evidently，but there were no correlations between esters formation and acids supply or consumption.The results revealed part of the rules of the esterification of main organic acids in yellow water，statistically confirmed the effects of the biological agent in esterification and aroma-producing，and provided scientific evidence for its subsequent application.

Nongxiang Baijiu；yellow water；esterification；biological agent

TQ920.9；TS262.3；TS261.4

A

1001-9286（2016）09-0071-05

10.13746/j.njkj.2016191

固态发酵资源利用四川省重点实验室项目（2015GTC001）；四川省教育厅基金项目（15ZB0291、11ZA225）；四川省大学生创业训练项目（201510641044）。

2016-05-31

游玲，E-mail：23686037@qq.com。

优先数字出版时间：2016-08-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160803.1013.002.html。