新型温敏性中空纤维膜的制备与表征

庄美玲，刘天庆，宋克东，王树萍



新型温敏性中空纤维膜的制备与表征

庄美玲，刘天庆，宋克东，王树萍

（大连理工大学化工与环境生命学部干细胞与组织工程研发中心，辽宁大连 116024）

采用自由基聚合方法对中空纤维膜（hollow fiber membranes, HFMs）进行了-异丙基丙烯酰胺（NIPAAm）的接枝聚合，制备了一系列PNIPAAm--HFMs，同时考察了成纤维细胞在PNIPAAm--HFMs表面的培养与降温脱附情况。傅里叶红外光谱和元素分析结果表明PNIPAAm成功地在中空纤维膜上接枝聚合。动态接触角分析结果显示，当温度降至LCST以下，PNIPAAm--HFMs表面接触角明显降低；蛋白黏附测定结果进一步证实了当温度发生改变时，PNIPAAm--HFMs表面呈现亲疏水性质变化，即具有温敏性。37℃时，成纤维细胞在HFMs-0.005, HFMs-0.01和HFMs-0.05表面均能正常黏附、铺展与增殖；而HFMs-0.2不适宜细胞的黏附与生长。降温孵育后，黏附于PNIPAAm--HFMs表面的细胞发生明显的形态变化并从其表面发生脱附，细胞脱附率高达90%以上。以上实验结果表明，PNIPAAm--HFMs具有良好的温敏性，可实现细胞的降温脱附，可与生物反应器相结合用于贴壁型细胞的大规模扩增与降温收获。

聚-异丙基丙烯酰胺；中空纤维膜；接枝聚合；温敏性；细胞脱附

引 言

组织工程和细胞移植等再生医学领域需要大量的种子细胞（109～1011）[1-2]，但是来源于人或者动物组织或体液中的原始种子细胞数量不足，因此体外扩增并收获大量保持生物学特性的种子细胞对再生医学具有重要的意义。由于具有较大的比表面积，中空纤维膜（hollow fiber membranes，HFMs）可为细胞黏附提供较大的面积，因此其常与生物反应器相结合用于体外细胞的大规模培养与扩增[3-4]。然而对于贴壁型细胞而言，如何有效并快速地实现细胞的收获是一个重要的问题。胰酶消化法是目前最常用的细胞收获方法。胰酶消化是通过选择性水解蛋白质肽链的方式切断贴壁细胞与培养基底之间的连接从而使细胞脱附[5]。该方法不仅会破坏细胞间的连接蛋白导致细胞的各自解离，更会切断整联蛋白与细胞骨架肌动蛋白之间的连接，导致细胞膜蛋白的损伤，进而破坏了细胞膜导致细胞功能的损失[6-7]。

温敏性材料聚-异丙基丙烯酰胺[poly(-isopropylacrylamide)，PNIPAAm]的研发为上述问题的解决提供了新思路。1990年，日本东京女子医科大学的Okano等[8]首次利用PNIPAAm制备了温敏表面，用于细胞的培养与降温非损伤性收获。PNIPAAm及其衍生物水溶液会随温度的改变发生可逆的相转变过程，发生相转变时的温度为最低临界溶解温度（LCST，一般在32℃左右）。以PNIPAAm为主的温敏表面可根据温度的改变呈现完全不同的构型和表面润湿性；在37℃时，温敏表面呈弱疏水性，适于细胞的黏附和生长；当温度低于LCST时，表面呈亲水性并发生溶胀，从而使细胞脱附。此后大量的研究结果均表明以PNIPAAm为主体的温敏表面可以有效地替代传统酶解法进行细胞的回收[9-11]。

关于温敏性中空纤维膜的制备并用于细胞培养与收获目前尚鲜有报道。Wang 等[12]采用过硫酸钾作为引发剂，在经过碱处理的PVDF中空纤维膜表面进行PNIPAAm的聚合修饰，制备了温敏性中空纤维膜。纯水动态流量实验表明，当PNIPAAm的接枝率为11%和36%时，该膜的纯水通量随温度发生改变，即当纯水温度低于PNIPAAm的LCST（约33℃），膜表面的PNIPAAm修饰层处于溶胀状态，导致PVDF中空纤维膜表面的孔被封闭，因而纯水的通量较低，当温度高于PNIPAAm的LCST时，PNIPAAm修饰层发生皱缩，膜表面的孔被释放，因而纯水的通量升高；此外他们在研究中也发现该温敏性PVDF膜在低温时具有很好的抗蛋白质污染性。然而，该研究的应用背景并不是细胞培养与收获方面。

基于上述分析，本研究采用硝酸铈铵作为引发剂，在经碱处理后的HFMs表面氧化产生自由基，进而进行PNIPAAm的接枝聚合，从而制备具有温敏特性的PNIPAAm--HFMs；并考察了成纤维细胞在PNIPAAm--HFMs表面的降温脱附行为。

1 实验材料和方法

1.1 试剂与仪器

-异丙基丙烯酰胺（-isopropylacrylamide，NIPAAm），纯度99%，百灵威科技有限公司；醋酸纤维素中空纤维膜（cellulose acetate hollow fiber membrane，HFM），外径175 μm, 内径149 μm，日本KAWASUMI；硝酸铈铵（ceric ammonium nitrate，CAN），国药集团化学试剂有限公司；HNO3和无水乙醇，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），美国ScienCell；低糖培养基（low glucose-dulbecco’s modified eagle’s medium，LG-DMEM），美国Gibco。

傅里叶变换红外光谱仪，美国Nicolet Instrument Inc；元素分析仪，德国VarioELⅢ；DCA-322动态接触角分析仪，美国Cahn公司；酶标仪，美国Bio-Tek公司；倒置相差显微镜，日本OLYMPUS OPTICAL CO. LTD。

1.2 PNIPAAm--HFMs的制备

将醋酸纤维素中空纤维膜在乙醇中浸泡清洗2 h后，置于0.05 mol·L-1NaOH 溶液中室温水解24 h，然后用大量的去离子水进行冲洗，25℃真空干燥备用。NIPAAm接枝改性中空纤维膜的过程参考文献[13-14]。将总长度为2000 cm的中空纤维膜置于三口烧瓶中，加入25 ml 0.1 mol·L-1的HNO3溶液，密封后通入氮气，同时置于水浴中加热至 60℃，氮气环境下加入0.137 g CAN；30 min后加入一定质量的NIPAAm （NIPAAm的浓度分别为0、0.005、0.01、0.05、0.1 和0.2 mol·L-1），置于25℃水浴、氮气保护下反应6 h。反应结束后，用大量去离子水冲洗PNIPAAm--HFMs（分别记为HFMs-0、HFMs-0.005、HFMs-0.01、HFMs-0.05、HFMs-0.1和HFMs-0.2），后置于去离子水中高压蒸汽灭菌，密封备用。

1.3 PNIPAAm--HFMs的表征

采用傅里叶变换红外光谱仪考察接枝PNIPAAm后中空纤维膜的化学结构。利用元素分析仪对中空纤维膜进行元素分析，并通过式（1）计算其PNIPAAm接枝量[15-16]。采用动态接触角分析仪，通过Wilhelmy吊片法分别测定20℃和37℃时PNIPAAm接枝改性后中空纤维膜的动态接触角。采用Bicinchoninic Acid （BCA）蛋白定量试剂盒测定接枝PNIPAAm后中空纤维膜在20℃和37℃时蛋白吸附量（μg·cm-2）。

grafted amount(1)

式中，p和0分别为PNIPAAm--HFMs和未接枝PNIPAAm的HFMs中N元素含量，%；p,theor为PNIPAAm聚合物N元素含量理论值；为HFMs的比表面积，1116 cm2·g-1。

1.4 PNIPAAm接枝改性中空纤维膜用于细胞的收获

将高压蒸汽灭菌后的PNIPAAm--HFMs平铺于培养皿中，PBS清洗3次，每次20 min；加入10% FBS+LG-DMEM，37℃下无菌孵育过夜。吸除培养基后，滴加50 μl 5×105cells·ml-1的SD大鼠新生鼠皮肤成纤维细胞，置于5% CO2、37℃培养箱中培养1 h后，二次接种，继续在培养箱中孵育3 h后，将中空纤维膜-细胞复合物移至新的培养皿中。培养2 d后，用37℃的PBS清洗两次，以去除未黏附至中空纤维膜上的细胞，然后加入新鲜无血清的冷LG-DMEM，在显微镜下连续观察细胞形态变化。

降温孵育至细胞变为圆形后，轻轻吹打中空纤维膜，收集脱附下来的细胞，未脱附的细胞采用胰酶消化法进行收获。采用血球计数仪对各组脱附下来的细胞及未脱附的细胞进行计数，并通过式（2）计算细胞的脱附率。

式中，1和2分别为脱附和未脱附的细胞数。

1.5 统计学分析

每组实验重复3次，采用Origin 7.5软件进行统计学处理，所有数据以“means±SD”表示，组间比较采用单因素方差分析和检验。＜0.05时具有显著性差异（*），＜0.01时具有非常显著性差异（**）。

2 实验结果与讨论

2.1 PNIPAAm--HFMs的化学结构表征

图1显示了中空纤维膜的衰减全反射-傅里叶变换红外光谱。羟基（OH）的伸缩振动吸收峰和亚甲基（CH2）的伸缩振动吸收峰分别出现在3350和2900 cm-1附近；与糖苷键伸缩振动有关的连续特征吸收峰出现在1020～1450 cm-1处，这些是典型的纤维素类特征峰。与未接枝PNIPAAm的中空纤维膜的红外光谱对比， PNIPAAm接枝修饰后的中空纤维膜在1650 cm-1处的羰基（CO）和1371 cm-1处的甲基（CH3）的伸缩振动吸收峰的强度增强，这主要是由于PNIPAAm中含有大量的羰基和甲基。此外在1550 cm-1处出现了新的酰胺键II（NH）的弯曲振动吸收峰，这说明PNIPAAm成功地接枝修饰到中空纤维膜上。

图1 HFMs的ATR-FTIR谱图

a—ungrafted HFMs; b—PNIPAAm--HFMs

表1展示出所制备的一系列温敏性中空纤维膜的N元素含量及PNIPAAm的接枝量。经过PNIPAAm修饰后，中空纤维膜中N元素的含量有所增加，且随着NIPAAm浓度增加，N元素的含量呈增加趋势，PNIPAAm的接枝量也相应增加，这也证实了PNIPAAm可成功在中空纤维膜上接枝聚合。然而，与理论接枝量相比，PNIPAAm在HFMs上的接枝量很少。这是由于在接枝聚合过程中，NIPAAm也会发生自聚反应，从而使实际接枝量小于理论值；此外，反应过程中无氧环境有可能受到破坏，氧气进入反应体系，导致了自由基淬灭，接枝聚合反应终止，进一步降低了PNIPAAm接枝量。

表1 HFMs氮元素含量及PNIPAAm接枝量

2.2 PNIPAAm--HFMs的温敏性

在调控细胞黏附与脱附时，PNIPAAm修饰后的表面在温度发生变化时所表现出的亲疏水性质的变化是一项重要的表面特性[17]。因此，本研究采用威廉吊片法和BCA法对中空纤维膜表面的润湿性与蛋白吸附能力分别进行了测定。

采用威廉吊片法，在20℃和37℃下分别对中空纤维膜表面的动态接触角进行检测，结果如表2所示。当温度由20℃升至37℃时，PNIPAAm修饰的中空纤维膜表面动态接触角增加，即中空纤维膜表面疏水性增强。这与PNIPAAm所具有的特性是一致的，即当温度低于LCST（32℃）时，亲水性基团（酰胺基）通过氢键作用与水分子相结合，PNIPAAm链呈舒展状态，从而导致温敏性表面呈现亲水性；当温度高于LCST时，亲水性基团与水分子间的氢键作用减弱，疏水性基团（异丙基）之间的疏水缔合作用增强，PNIPAAm链呈蜷缩状态，从而导致温敏性表面呈现疏水性[18-19]。与此同时对比不同组的动态接触角后发现，当PNIPAAm接枝量增大时，表面的接触角会有所下降，这可能是由于当中空纤维膜表面PNIPAAm接枝量增加时，中空纤维膜表面PNIPAAm层相应变厚，导致其表面在37℃和20℃时均呈现高度水合状态，因而动态接触角有所减小，表面亲水性增强[20-21]。

表2 中空纤维膜的动态接触角

此外表2还表明了温敏性中空纤维膜表面的PNIPAAm接枝量与不同温度间动态接触角的差值之间的关系。即当PNIPAAm接枝量由2.65 μg·cm-2增加至44.09、50.65、62.58 μg·cm-2时，37℃和20℃间的动态接触角差值呈下降趋势。这可能与温敏性表面的PNIPAAm层厚度和构象有关[20]。当温度从37℃降至20℃时，位于表面最外层的PNIPAAm链发生快速的疏水缔合，进而在最外层形成较致密层，阻止了内部水分子的排出。因此PNIPAAm层较厚时，其构象改变程度较小，动态接触角的变化差值相应会比较小。

与细胞黏附有关的蛋白在基底表面的黏附是细胞在材料表面黏附的重要过程，也是用来评价材料表面温敏性的重要指标，因而本研究测定了37℃和20℃时胎牛血清蛋白在温敏性中空纤维膜表面的黏附量。胎牛血清是去除血浆中的纤维蛋白而形成的一种复杂的混合物，其包含多种蛋白质，如与细胞黏附息息相关的层粘连蛋白和纤维连接蛋白，以及促进细胞间相互联系和生长的胶原蛋白等。胎牛血清是体外培养细胞重要的组成部分，因此本研究选用胎牛血清作为模型蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒对中空纤维膜的表面蛋白黏附能力进行了检测，结果如图2所示。经过PNIPAAm修饰后的中空纤维膜在20℃和37℃下的蛋白黏附量大多小于未经PNIPAAm修饰的中空纤维膜表面的蛋白黏附量。有研究表明当含有亲水性基团的聚合物在基底表面的接枝量致密时，由于空间位阻效应，蛋白黏附量较低[17,22]。因此，当PNIPAAm接枝量由2.65 μg·cm-2增加至44.09、50.65和62.58 μg·cm-2时，表面的蛋白黏附量呈下降趋势。此外，经PNIPAAm修饰后的中空纤维膜在20℃时的蛋白黏附量明显小于37℃时的蛋白黏附量；当温度为20℃时，中空纤维膜表面由于呈现亲水性，导致胎牛血清中的疏水性蛋白（纤维连接蛋白和层粘连蛋白）不易黏附到其表面；当温度升至37℃时，由于PNIPAAm链的疏水缔合作用，使其PNIPAAm层结构由舒展状态变化为蜷缩状态，从而使中空纤维膜表面呈现出疏水性，进而利于疏水性的蛋白的黏附[23-24]。因此，温敏性中空纤维膜表面的蛋白黏附能力不仅与温度有关，还与PNIPAAm的接枝量有关。

图2 20℃和37℃时PNIPAAm-g-HFMs表面蛋白吸附量

NS—not significant; *—＜0.05; **—＜0.01

2.3 成纤维细胞在PNIPAAm--HFMs表面的培养与降温脱附

将成纤维细胞接种到PNIPAAM--HFMs表面上进行培养，12 h和48 h后观察细胞状态，结果如图3所示。培养12 h后，细胞可在HFMs-0.005、HFMs-0.01和HFMs-0.05表面黏附并呈铺展状态，与对照组HFMs-0相比，细胞形态无明显差异。而HFMs-0.2组不适宜细胞的黏附，细胞多呈圆形。培养48 h后，HFMs-0.2组只有少量的细胞黏附，大量的细胞迁移至培养皿底部生长增殖；其他组HFMs表面上细胞铺满中空纤维膜表面，表现出良好的增殖能力。与此同时，HFMs之间细胞出现了搭桥的现象。

图3 成纤维细胞在中空纤维膜表面的生长形态

培养2 d后，对成纤维细胞在HFMs-0、HFMs- 0.005、HFMs-0.01和HFMs-0.05表面降温脱附过程进行考察。图4展示了降温脱附过程中细胞形态的变化。降温孵育过程中，HFMs-0表面的细胞一直处于黏附铺展状态，细胞形态无明显变化[图4(a)]。而PNIPAAm--HFMs组的细胞形态均发生了明显的变化。如图4(b)所示，加入20℃培养基孵育40 min后，HFMs-0.005表面黏附的细胞由铺展状态变为圆形皱缩状。HFMs-0.01表面细胞的形态变化较快，孵育20 min后，铺展状态的细胞便完全皱缩变圆[图4(c)]。而HFMs-0.05表面上细胞完全皱缩变圆需要降温孵育30 min[图4(d)]。当细胞形态变圆后，轻轻吹打中空纤维膜，细胞团簇便可从温敏膜表面完全脱附下来。上述结果与Okano等[25]报道的细胞在温敏材料表面降温脱附时首先发生细胞形态的变化、随后从材料表面脱附的过程相一致。此外，各组PNIPAAm--HFMs降温收获细胞效率均达90%以上，而未经过PNIPAAm修饰的HFMs-0组细胞脱附率仅为4.27%±1.64%。即PNIPAAm--HFMs可有效地通过降温处理收获细胞。

图4 降低温度后HFMs表面成纤维细胞的形态变化

在细胞降温脱附过程中，PNIPAAm接枝量不同，细胞形态完全皱缩变圆所需要的时间也不相同。当PNIPAAm接枝量由0.8 μg·cm-2增加至2.65μg·cm-2时，细胞发生明显形态变化所需要的时间缩短，而当接枝量继续增加至44.09 μg·cm-2时，脱附过程耗时增加。这与温敏性中空纤维膜表面的亲疏水性质的变化程度有关。接枝量过低或者过高时，温敏表面的亲疏水性质变化程度较弱，因此细胞受到的脱附推动力也就较弱，细胞脱附过程所需要的时间也就较长。

Knazek等[26]于1972年首次报道了将中空纤维膜用于细胞培养。由于具有较大的比表面积，中空纤维膜可为黏附型细胞提供高达200 cm2·ml-1的黏附表面，从而实现细胞高密度（108cells·ml-1）的培养；此外中空纤维膜的多孔结构也可加速营养代谢物质的传递、有利于细胞间信号传导和细胞因子的相互作用，可更真实地模拟细胞在体内生长的微环境[27]。因此，利用中空纤维膜生物反应器可以进行细胞的大规模培养与扩增。对中空纤维膜进行PNIPAAm接枝修饰后，中空纤维膜不仅可保持其原有优势，而且具有了温敏特性。这种温敏性中空纤维膜用于细胞培养时可通过改变培养基的温度来调节细胞的黏附与脱附，即当培养液温度高于LCST（约32℃）时，中空纤维膜表面呈弱疏水性，由疏水性蛋白（如纤维连接蛋白、层粘连蛋白）介导的细胞黏附过程可实现细胞在中空纤维膜上黏附与生长；当培养液温度降至20℃时，中空纤维膜表面变为弱亲水性，疏水性蛋白与中空纤维膜间的锚定作用减弱，此时细胞在细胞骨架重建作用下发生形态变化（由铺展状态变为圆形）进而从其表面脱附下来。综上所述，温敏性中空纤维膜可用于黏附型细胞的大规模培养与非酶解收获。

表3 成纤维细胞在HFMs表面的降温脱附率

3 结 论

（1）ATR-FTIR图谱分析及元素分析实验结果均表明PNIPAAm能接枝聚合到HFMs上。单体溶液中NIPAAm溶度增大，会使HFMs上的PNIPAAm接枝量增加。

（2）动态接触角和BCA蛋白定量测定结果均证实PNIPAAm--HFMs可随温度改变发生亲疏水性变化，即具有温敏性。

（3）细胞生长与脱附实验表明，HFMs-0.005、HFMs-0.01和HFMs-0.05均可用于细胞的培养与降温收获；当PNIPAAm接枝量为2.65 μg·cm-2时，细胞脱附过程耗时最少。

（4）PNIPAAm接枝量在一定程度上影响PNIPAAm--HFMs的温敏性；接枝量过高过低时，其表面亲疏水性变化程度较低，细胞脱附所需时间增加。因此，在制备温敏性中空纤维膜时，PNIPAAm接枝量一定要控制在适宜的范围内。

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Preparation and characterization of novel thermo-responsive hollow fiber membranes

ZHUANG Meiling, LIU Tianqing, SONG Kedong, WANG Shuping

(Dalian R&D Center for Stem Cell and Tissue Engineering, Faculty of Chemical, Environmental and Biological and Technology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China)

Owing to the large scale area-to-volume ratio involved, hollow fiber membranes (HFMs) provide a tremendous amount of surface area for cell adhesion. Therefore, HFMs are widely used for large-scale expansion of cells. Traditionally, trypsinization is empolyed to harvest adhered cells from the surface of HFMs. However, this proteolytic enzyme treatment will destroy cell viability and function. Therefore, this study prepared a serious poly(-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) grafted HFMs (PNIPAAm--HFMs) with different grafted amounts, and the fibroblasts culture and detachment from PNIPAAm--HFMs with temperature reduction was also investigated. ATR-FTIR and elemental analysis results indicated that the PNIPAAm was covalently grafted on HFMs successfullyfree radical polymerization in the presence of cerium (Ⅳ). Dynamic contact angle measurements showed that the surface contact angle of water on PNIPAAm--HFMs decreased significantly when the temperature dropped below LCST. Additionally, the protein adhesion assay results further confirmed that PNIPAAm--HFMs exhibited thermo-responsive property, namely hydrophilic-hydrophobic phase transition with temperature changed. MEFs adhered, spread and grew well on the surface of PNIPAAm-grafted HFMs except HFMs-0.2 at 37℃. In addition, the experiment of cell detachment showed that the cell can be released from PNIPAAm--HFMs with decreasing temperature and detachment efficiencies were above 90%. In conclusion, the PNIPAAm--HFMs with thermo-responsive property can be an attractive candidate for cell large-scale expansion and cell detachment with temperature reduction.

poly(-isopropylacrylamide); hollow fiber membranes; grafting polymerization; thermo-responsive; cell detachment

2016-05-27.

Prof. LIU Tianqing,liutq@dlut. edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20160723

Q 813.1；TB 381

A

0438—1157（2016）11—4866—07

庄美玲（1988—），女，博士研究生。

国家自然科学基金项目（31170945）。

2016-05-27收到初稿，2016-07-19收到修改稿。

联系人：刘天庆。

supported by the National Natural Science Foundation of China (31170945).