上调基因-11（URG11）生物信息学与功能分析

姚杨 苏杰 刘凯歌 徐锐

（西安医学院第一附属医院，西安 710077）

上调基因-11（URG11）生物信息学与功能分析

姚杨 苏杰 刘凯歌 徐锐

（西安医学院第一附属医院，西安 710077）

应用基因芯片技术获取以稳定转染HBx基因的肝癌细胞HepG2（HepG2-X）Y，以及非转染的肝癌细胞HepG2的差异表达基因，利用生物信息学方法对其进行初步分析表明，该蛋白基因编码673个氨基酸，预测分子量为17.06 kD，理论等电点为4.83，定位于细胞核，具有转录调控、生长因子、信号传导的功能，同源性分析结果表明，其碱基序列与已经报道的其他12个物种的相似率为76%-97%，且符合种属之间的进化关系。

乙肝相关性肝癌；生物信息学分析；URG11；HBx

目前，我国每年约有11-13万人死于原发性肝癌，占全球肝癌死亡数的半数之多。在诱发肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的众多因素中，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染占到50%以上［1-3］。流行病学和分子生物学研究认为HBV是HBV相关性HCC发生的高危因素。HBx（Hepatitis B virus X protein）是HBV四个开放读码框架中X编码的一种病毒多功能蛋白，研究发现X基因表达产物（HBx）在肝癌形成过程中参与肝癌血管生成，但作用机理并不明确［4，5］。URG11（upregulated gene11）是一个可被HBx蛋白上调的基因，能促进肝癌细胞G1期向S期进展，与肿瘤的发生、发展和转移密切相关的基因［6，7］。

URG11与肿瘤关系的相关的报道已经很多，但并未对其进行详细的生物信息学分析。本实验通过HBx基因稳定转染的HepG2细胞为实验组，非转染的肝癌细胞HepG2为对照组，通过Agilent人全基因芯片筛选差异表达基因，通过生物信息学方法对其进行分析，旨在为HBV相关肝癌的发生、转移的诊断、靶基因治疗和预后评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌细胞系HepG2及HepG2-X均为本实验室保存。10%小牛血清（四季青生物工程工司），RPMI-1640培养基（Gibco公司）；消化液（0.02%EDTA 0.25%胰蛋白酶）；DEPC水；Agilent人类全基因4×44K芯片；Agilent Microarray Scanner和Agilent feature extraction数据分析软件。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片 用Trizol［8］法分别抽取实验组及对照组细胞总RNA，紫外分析及电泳检测，合成有荧光标记的cDNA探针并纯化，将基因芯片和杂交探针分别在95℃水溶液中变性5 min，将探针加在芯片上，盖玻片封片，65℃，10 r/min，滚动杂交17 h，实验组和对照组分别杂交上样量825 ng，60℃下用SCC和0.2%SDS分别洗2 min，室温晾干。片结果采用Agilent Microarray Scanner进行扫描，用Feature Extraction software 10.7读取数据，最后采用Gene Spring Software 11.0进行归一化处理，所用的算法为Lowess。

1.2.2 序列的生物信息学分析 利用BLAST在线分析工具分别对GenBank 的非冗余核算数据库和非冗余蛋白质数据库序列进行比对分析；采用NCBI的ORF finder［9］对URG11开放阅读框进行预测；利用ExPASy 的ProtParam［10］程序统计基因中各种氨基酸含量，并预测理论分子量和等电点；应用ProtScale［11］程序进行蛋白质的疏水性分析；跨膜结构域分析采用TMHMM软件预测［12］。信号肽采用SignalP3.0server工具分析［13］。磷酸化位点分析采用蛋白质亚细胞定位NetPhos2.0 Server在线分析工具［11］。采用在线工具（http：//psort nibb.ac.jp/form. html）预测，通过NCBI数据库GenBank 分析蛋白质保守结构域；采用Protfun在线工具预测URG11的功能分类［14］；采用同源模型服务软件SWISSMDEL［15，16］预测URG11的三维结构；采用MEGA5.0软件进行系统进化树的构建。

2 结果

2.1 开放阅读框分析

本研究利用NCBI ORF Finder对URG11在线分析表明其在+1阅读框有最长的开放性读码框，长度为2 020 bp编码673个氨基酸残基（图1）。

图1 人URG11基因序列的ORF分析

2.2 保守结构域预测

利用NCBIBLAST 工具进行保守区分析，发现URG11氨基酸序列中含有4个保守的作用位点，如图2所示。

2.3 理化性质分析

利用ExPASy 在线工具ProtParam对URG11基因编码产物的理化性质预测结果表明，其中含量最多的两种氨基酸是Cys（C）和Gly（G），所占比例分别为34.4%和27.8%理论分子量为17.06 kD，理论等电点为4.83。

根据蛋白质亲水性/疏水性分析原理，利用ExPASy ProtScal程序，对人URG11基因编码产物的疏水性进行分析，结果（图3）显示，整条多肽链表现为亲水性，由此可知人URG11是一种可溶性蛋白。

2.4 跨膜结构域分析

TMHMM综合了跨膜区疏水性、螺旋长度和膜蛋白拓扑学限制等性质，用马氏模型对跨膜区及膜内外区进行整体预测。本实验利用TMHMM对URG11进行跨膜结构的分析，结果表明此蛋白不含跨膜位点。

图2 保守域预测结果

图3 ProtScal程序分析URG11编码产物的疏水性结果

图4 URG11跨膜结构预测产物信号肽预测

信号肽（signal peptide）是一段由3-60个氨基酸组成的短肽序列，它是引导新合成蛋白质被输送至目的地点的识别信号，也被称为靶标信号。利用SignalP 3.0 Server工具对人URG11信号肽进行预测，结果（图5）表明，该蛋白不含信号肽。

图5 URG11编码产物氨基酸序列信号肽预测

2.5 磷酸化位点分析

磷酸化和去磷酸化在多种真核细胞中具有重要的作用，如新陈代谢、细胞分裂及信号转导等，利用NetPhos2.0 Server在线分析工具对URG11磷酸化位点分析，结果（图6）发现有29个丝氨酸和12个苏氨酸可能被磷酸化。

2.6 编码产物功能预测及分析

通过Protfun预测URG11编码产物的功能，从分析结果（表1）可知，URG11具有转录调控、生长因子、信号传导的功能，可能性分别为0.854、0.476、0.365。

2.7 URG11保守域预测与高级结构分析

通过Swiss-Modeling软件对URG11的氨基酸序列进行蛋白质三维结构的同源建模，获得其氨基酸序列的预测三级结构（图7）。

2.8 同源比对和系统进化树分析

将URG11氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸和蛋白质一级结构水平上进行同源性比较，结果（表2）表明其在进化中十分保守，与其他12种物种URG11氨基酸水平的相似性为76%-97%。同时也反映了URG11编码产物在不同物种结构上的稳定性对生物体功能的重要性。根据URG11基因特征序列和保守序列在GenBank数据库进行检索，物种间系统进化树（图8）分析表明，白颊长臂猿、苏门答腊猩猩、猕猴的亲缘关系较近。

图6 NetPhos2.0 Server预测磷酸化位点

表1 URG11编码产物功能分析结果

图7 URG11氨基酸序列高级结构分析结果

表2 URG11与其他近缘物种该蛋白基因氨基酸序列同源性

图8 不同物种URG11编码产物系统发育树

3 讨论

URG11最早是利用抑制消减杂交及全长PCR扩增技术克隆的一个基因，该基因定位于人11号染色体长臂，能促进肝癌细胞系的增殖、分化并促进肝癌细胞裸鼠体内的成瘤能力，更重要的是将此基因转染入肿瘤细胞，可促进B-连接蛋白（B-catenin）的表达。B-catenin不仅在维持细胞正常形态及介导细胞运动中发挥重要作用，还是与肿瘤发生及发展密切相关的Wnt信号转导通路中的关键分子［17，18］。Peng 等［19］发现URG11通过上皮间质转化促进胰腺癌的侵袭，从而导致预后效果不佳。Fan等［20］发现抑制URG11，HCC细胞可通过下调G1-S期相关蛋白抑制细胞增殖，通过下调BCL-2诱导细胞凋亡。

虽然关于URG11基因的报道已经很多，但并未对其进行详细的生物信息学分析。本研究通过基因芯片技术筛选出HBx参与的乙肝相关性肝细胞性癌差异表达基因URG11，对其同源性比较结果表明，其碱基序列与已经报道的其他12个物种的相似率为76%-97%，与其他物种比较，URG11基因氨基酸序列表现出高度保守性，以保证其执行重要的生物学功能。利用MeGa5.0软件基因NJ法构建系统进化树，人URG11与大猩猩、黑猩猩、普通狨该基因的分子进化距离最近，亲缘关系最密切，这与动物学分类结果一致，这种同源性在一定程度上代表着物种亲缘关系的远近，同时也反映了URG11编码产物在不同物种结构上的稳定性对生物体功能的重要性。随着对URG11结构和功能的深入研究，针对URG11的干扰和抑制可能成为一种新型的临床分子靶点抗癌药物。

4 结论

本研究结合分子生物学技术和生物信息学分析，通过基因芯片技术筛选出HBx参与的乙肝相关性肝细胞性癌差异表达基因URG11，该基因编码673个氨基酸，预测分子量为17.06 kD，理论等电点为4.83，同源性分析结果表明，其碱基序列与已经报道的其他12个物种的相似率为76%-97%，且符合种属之间的进化关系。亚细胞定位于细胞核的可能性大，具有转录调控、生长因子、信号传导的功能。

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（责任编辑 李楠）

Function Analysis of Up-regulated Gene（URG11）Based on Its Bioinformatics

YAO Yang SU Jie LIU Kai-ge Xu Rui
（The First Affiliated Hospital of Xi'an Medical University，Xi'an 710077）

This work was to obtain differentially-expressed genes with hepatoma cell HepG（HepG2-X）Y of stable transfected HBx and non-transfected hepatoma cell HepG2using gene chip technology. The preliminary bioinformatic analysis demonstrated that the gene of the protein encoded 673 amino acids with a predicted molecular weight of 17.06 kD and pI 4.83. URG11 were mainly localized in the nuclear and played the role in transcription regulation，growth factor and signal transducer，and it showed 76%-97% identity with the others reported 12 species，as well as was consistent with the evolutionary relationship between species.

HBV-related hepatocellular carcinoma；bioinformatics；URG11；HBx

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.032

2015-06-04

西安市科技计划项目（SF1418（6）），西安医学院科研项目（12FZ15），西安医学院附属医院科研项目（XYFY11-14）

姚杨，硕士研究生，研究方向：生化与分子；E-mail：yaoyang1220@sina.com