巴西橡胶树响应乙烯利刺激的生理及其分子调控机制研究进展

位明明 李维国 高新生 黄肖

（中国热带农业科学院橡胶研究所 国家橡胶树育种中心 农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，儋州 571737）

巴西橡胶树响应乙烯利刺激的生理及其分子调控机制研究进展

位明明 李维国 高新生 黄肖

（中国热带农业科学院橡胶研究所 国家橡胶树育种中心 农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，儋州 571737）

生产中施用乙烯利刺激已成为提高橡胶树产量的重要手段，并在天然橡胶生产中大面积推广应用。然而，关于橡胶树响应乙烯利刺激的调控机制尚不清晰，成为橡胶树新型刺激剂研制，以及耐乙烯利刺激新品种选育中亟待解决的问题之一。综述了近年来橡胶树乙烯信号转导通路相关基因的研究现状，橡胶树响应乙烯利刺激的生物学调控机制研究进展，以及乙烯利刺激对橡胶树的副作用，以期为深入研究橡胶树响应乙烯利刺激的分子机制提供参考。

橡胶树；乙烯利；调控机制

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）属大戟科橡胶树属，为多年生异花授粉乔木，其合成的天然橡胶能广泛应用于国防建设和国民经济生产的各个领域，具有重要的战略意义和经济价值［1］。由于中国地处热带北缘，风害与寒害频发，适合橡胶树种植的区域极为有限，使得国内天然橡胶供需矛盾尤为突出，提高橡胶树单位面积产量成为解决天然橡胶供需矛盾的最有效途径之一［2］。

目前，乙烯利刺激作为橡胶树增产的重要手段和主要刺激因子，已被广泛应用于天然橡胶生产［3］。研究表明涂施乙烯利可促使橡胶树胶乳产量增加1.5-2倍，被誉为天然橡胶产业的第二次技术革命［4］。作为现代割胶制度的重要组成部分，中国在2006 年新颁布的《橡胶树割胶技术规程》中也提出推广乙烯利刺激割胶制度［5］。根据该规程的建议，橡胶树传统割胶方式要逐步向乙烯利刺激的低频高效方向转变，以药代工，以药代皮，降低割胶频率，提高割胶效率和效益［6］。然而，迄今关于橡胶树响应乙烯利刺激的分子机制尚不清晰。此外，高浓度乙烯利刺激割胶后，容易导致橡胶树死皮病（橡胶树割面乳管发生生理性病变，导致树皮干涸，乳管丧失排胶功能的现象）的发生，严重影响天然橡胶的可持续性发展［7］，已成为天然橡胶生产中亟待解决的问题之一。因此，积极开展橡胶树响应乙烯利刺激的分子调控机制研究，不仅对于合理指导乙烯利刺激技术、研制高效、低伤害的新型刺激剂，以及乙烯利精准施药具有一定的实践指导意义，而且可为橡胶树耐乙烯利刺激新品种选育提供理论依据与技术手段。本文综述了橡胶树中乙烯信号转导通路相关基因的研究现状，橡胶树响应乙烯利刺激的生理生化及分子生物学基础，以及乙烯利对橡胶树的副作用，以期为今后深入研究橡胶树响应乙烯利刺激的分子机制提供参考。

1 橡胶树中乙烯合成通路及信号转导通路

1.1 植物中乙烯生物合成通路

乙烯作为植物生长发育中重要的激素调控因子，在植物生长周期的多个阶段发挥着重要作用。在植物体内乙烯的生物合成通路已经十分清楚，其生物合成所需最基本的前体物质为蛋氨酸，首先蛋氨酸在腺苷蛋氨酸合成酶的作用下，转化成S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）；接着SAM在氨基环丙烷羧酸（ACC）合成酶的催化反应下合成ACC；最后ACC在ACC氧化酶（ACO）的催化下氧化生成乙烯［8］。

多年来对乙烯信号转导通路的研究已经揭示出导致转录因子激活的线性通路，这些转录因子属于乙烯响应因子（ethylene response factor，ERF）家族。ERF作为转录因子家族中最重要的一类成员，它们在生物胁迫及非生物胁迫的激素、糖信号及氧化还原信号中起关键作用［9］。ERF具有一个保守的AP2结构域，能参与DNA绑定，该区域大约由60个氨基酸残基组成，能识别下游靶基因的GCC/DRE盒子。根据AP2保守结构域不同，Nakano 等［10］和Sakuma 等［11］将ERF划分为10种或数个不同的亚家族，其中绝大多数物种中ERF属于AP2/ERF亚家族。

1.2 橡胶树中乙烯合成及信号转导通路

目前，橡胶树中乙烯合成及信号通路已被广泛研究［12-14］。借助于新一代高通量测序技术，前人已从橡胶树的胶乳、树皮、叶片、茎及体细胞胚等不同组织中鉴定出172个包含AP2结构域的转录因子，其中142个转录因子具有完整的AP2结构域［15］。在橡胶树中ERF家族有115个成员组成，它们被划分为10个主要的亚家族，其中50%以上HbERF属于VII、VIII和IX亚组。进一步研究证实一些HbERF基因的表达与体细胞胚胎发生［16］、乳管分化［17］及非生物胁迫密切相关［18］，表明乙烯信号通路相关基因在橡胶树的生长发育与胶乳代谢过程中起重要作用。

2 乙烯刺激橡胶树增产的生理生化和分子生物学基础

2.1 天然橡胶的合成部位及途径

巴西橡胶树合成的天然橡胶储藏与树皮的乳管中，待橡胶树成龄后，胶工以切割树皮乳管的方式来收集胶乳，获取天然橡胶。橡胶树合成的天然橡胶主要成分是顺式-聚异戊二烯，其生物合成过程属于典型的植物类异戊二烯次生代谢途径，进一步研究表明天然橡胶是在乳管细胞质的橡胶粒子表面合成［19］，是一个酶促顺-1，4-异戊二烯聚合到长链的聚异戊二烯橡胶分子的过程。

目前天然橡胶的生物合成途径已大致了解，其生物合成过程大致分为3个阶段［20，21］：（1）乙酰-CoA的形成：天然橡胶的生物合成首先是以蔗糖为原料，经过糖酵解和三羧酸循环生成乙酰辅酶A。（2）异戊二烯类化合物的生成：利用ATP为能量，以磷酸戊糖途径产生的NADPH为还原剂，乙酰辅酶A转变为甲羟戊酸（mevalonic acid，MVA），再由MVA转变成异戊烯基焦磷酸（isopenteny diphosphate，IPP），接着IPP在IPP异构酶的催化作用下生成二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP或DMADP）。（3）IPP聚合形成橡胶分子：IPP 在反式异戊二烯转移酶（farnesyl pyrophosphate，FPP或FDP）的催化下，将IPPs 加在DMAPP 上生成C10、C15等异戊二烯类化合物，在橡胶转移酶催化下，IPP 添加到异戊二烯类化合物上形成橡胶分子，该过程包括橡胶分子的起始、延伸和终止等3步。前期对天然橡胶合成通路相关酶类的研究分析表明：橡胶树乳管细胞中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR）、法尼基二磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，FDP）及橡胶转移酶（rubber transferase，RuT）是天然橡胶合成途径中3个关键性限速酶［22］，它们对于天然橡胶的生物合成具有重要意义。

2.2 橡胶树响应乙烯利刺激的生理生化基础

自20世纪60年代，研究人员发现乙烯利作为一种能够显著提高胶乳产量的采胶刺激剂以来，关于橡胶树响应乙烯利刺激的生理及分子调控机理研究就未中断过。早期有关乙烯利刺激对橡胶树作用机制的研究多集中在产量效应和生理参数方面，分析乙烯利刺激对橡胶树胶乳代谢过程中相关生理生化指标的影响及变化规律是这些研究的主要内容。如D'Auzac等［23］认为乙烯利涂抹于橡胶树割面后，可以增加树皮内层乳管细胞的澎压与可塑性，以及降低胶乳凝聚来增加胶乳外流时间，从而提高橡胶树产量。Sainoi和Sdoodee［24］报道施用乙烯利刺激后对橡胶树胶乳生理产生一定影响，使得胶乳稳定性增强。Tupy［25］发现外源乙烯可促进橡胶树韧皮部和木质部中淀粉的水解，加速水分和养分的吸收。Jetro和 Simon［26］发现橡胶树涂施乙烯利后，不仅对其胶乳产量和胶乳生理产生影响，而且这种影响随着橡胶树生长季节的变化而变化。

总之，在胶乳代谢的生理生化水平，早期有关乙烯利刺激对橡胶树作用机制的研究观点主要集中在以下两个方面：第一种观点认为乙烯利刺激不仅能提高橡胶树胶乳代谢活性，使得胶乳稳定性增强，排胶时间延长，而且还能扩大橡胶树排胶影响面，增强乳管中胶乳再生能力，从而获得较高产量；第二种观点认为乙烯利在橡胶树产胶系统中能通过诱发酶的合成和调节酶活性［27］，导致胶乳流速加快，增强排胶功能，从而有利于多聚异戊二烯的合成与再生。

2.3 橡胶树响应乙烯利刺激的分子生物学基础

乙烯利对橡胶树的作用机制首先涉及乙烯信号转导，揭示乙烯利刺激橡胶树增产过程中的乙烯信号转导通路可能是揭示乙烯利刺激橡胶树增产的关键。随着分子生物学的飞速发展，分析橡胶树胶乳代谢相关基因的乙烯利调控模式对其产量的影响成为相关研究的主要内容［28］。由于天然橡胶的生物合成涉及产胶、排胶及乳管发育等3个主要生物学过程，前人围绕乙烯利刺激橡胶树增产的研究主要集中在以上3个方面。

2.3.1 乙烯利促进产胶及其机制 橡胶树所产胶乳中90%以上的干物质是橡胶烃，而橡胶烃的合成代谢与糖酵解途径密切相关，因此，胶乳中蔗糖含量及其代谢强度是影响橡胶生物合成的第一限制因子。诸多研究证实乙烯利刺激橡胶树后蔗糖转运和代谢加速可能是影响乙烯利刺激橡胶树增产的主要原因。如Tupy［29］证实乙烯利刺激能显著提高橡胶树胶乳中转化酶的活性，从而加速糖酵解过程，提高蔗糖和水分等物质对乳管的供应，为胶乳代谢和橡胶的合成和再生提供有利条件。Gidrol等［30］研究表明乙烯利处理橡胶树后12-72 h内，原生质膜上的ATPase酶活性提高了2-4倍，且ATP/ADP 比值与胶乳产量呈极显著相关，激活的ATPase酶可提供蔗糖运输所需要的能量，表明乙烯利刺激能促使蔗糖转运加速，从而增强产胶过程。Dusotoit-Coucaud等［31］研究表明乙烯利处理后胶乳中两个蔗糖转运蛋白基因HbSUT1A和HbSUT2A的表达均受到乙烯利的诱导，从而证实乙烯利刺激可通过转运蔗糖进入乳管的方式参与橡胶树增产的过程。黄德宝等［32］利用RT-PCR和RACE技术，从橡胶树中克隆了6个蔗糖转运蛋白基因的全长cDNA，分别将其命名为：HbSUT1、HbSUT2A、HbSUT2B、HbSUT3、HbSUT4和HbSUT5，进一步研究分析表明乙烯利刺激能够上调HbSUT2A、HbSUT2B和HbSUT3的表达，暗示这3个蔗糖转运蛋白基因可能共同参与了乳管的蔗糖供给，与乙烯利刺激增强乳管代谢能力相关。随后，李和平等［33］又对HbSUT5基因进行功能分析，结果表明HbSUT5基因在胶乳、树皮及叶片中均呈高丰度表达，而且该基因在叶片发育早期表达丰度最高，之后随叶片发育进程表达量呈逐步下降趋势。然而，进一步研究表明HbSUT5基因在胶乳中的表达却不受乙烯利诱导，这种表达模式与决定乳管蔗糖供给和橡胶产量的关键基因HbSUT3明显不同，初步认为HbSUT5基因可能在橡胶树幼嫩组织发育的“碳源”供给上起作用，参与了对乳管蔗糖供给的调控。陈鑫等［34］通过筛选乙烯利刺激条件下巴西橡胶树胶乳和未处理胶乳差异表达的cDNA消减文库，克隆到一个编码钙依赖蛋白激酶的基因HbCDPK1，进一步研究分析表明该基因不仅具有明显的组织特异性，其在胶乳中的表达量明显高于其他组织，而且能够参与调控蔗糖代谢。此外，该基因在胶乳中的表达亦受到茉莉酸、乙烯、机械伤害的诱导，表明HbCDPK1通过多种方式参与胶乳合成相关的蔗糖代谢调控。

在产胶方面，关于乙烯利刺激对天然橡胶合成通路相关基因的表达模式是否能产生影响，前人也开展了相关研究，但至今无任何直接证据表明乙烯利能够促进天然橡胶合成途径中关键酶基因的表达［35］。许多研究证实乙烯利对橡胶生物合成主要途径中关键酶基因的表达无显著影响，如3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶、法尼基二磷酸合酶，以及橡胶延伸因子和小橡胶粒子蛋白的基因表达均不受乙烯利调节［36-38］。此外，还有研究证明乙烯利不能促进胶乳反式异戊烯基转移酶（tranprenyl transferase，FPP）基因的表达［39］，而FPP是橡胶生物合成的重要限制因子之一，它对橡胶生物合成的启动起决定作用，表明乙烯利刺激对天然橡胶的主要合成途径没有直接促进作用。然而，Suwanmanee等［40］发现乙烯利刺激却能够显著增加3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthase，HMGS）的酶活性及mRNA的积累，HMGS能够催化乙酰乙酸辅酶A 形成HMGR，在橡胶生物合成的早期阶段起作用，可能为橡胶的生物合成提供原料，从而促进橡胶增产，这是乙烯利刺激能够促进橡胶合成途径相关酶基因表达的首次报道。此外，近年来研究发现MVA 途径并非植物体内IPP合成的唯一途径，借助于13C-标记的前体示踪发现，通过2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径（2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate，MEP途径）也能合成类异戊二烯的前体物质IPP［41］，表明天然橡胶的生物合成存在其他分支途径。进一步研究证实MEP途径受到乙烯利刺激的显著影响，该途径中许多基因的表达均受乙烯的诱导，如在橡胶树胶乳中克隆到MEP途径中2个关键酶基因4-二磷酸-2-C-甲基-D-赤藓糖醇磷酸激酶（4-Diphosphocytidy l-2-C-methyl-D-ery thritol Kinase，CMK）和4-羟基-3-甲基 -2-（E）-丁烯基-4-磷酸还原酶（4-hydroxy-3-methyl-2-（E）-butenyl-4-diphosphate reductase，HDR）的表达都受到乙烯利的诱导［42，43］，且乙烯利能够上调HbCMK和HbHDR基因的表达水平，暗示乙烯利刺激可以加速MEP途径的代谢进程，推测乙烯利可能通过其他旁支途径起相关生物学效应。

2.3.2 乙烯利促进排胶及其机制 橡胶树的排胶是指乳管被割断或受机械损伤后胶乳溢出的现象。其对胶乳产量的影响主要表现在胶乳的流速和延续时间两方面，尤其是对胶乳流的延续时间对胶乳产量的影响最为显著。割胶后随着胶乳的外流，乳管割口处因胶乳絮凝而引起的乳管内堵塞的现象被称为胶乳的停排。实践证实乙烯利刺激割胶可以延缓乳管内堵塞现象，加速水分吸收，同时大量动员贮备养料，并集中于乳管系统，使排胶时间延长，胶乳产量增加［44］。

在排胶方面，关于乙烯利刺激橡胶树增产的原因主要集中在以下3个方面：（1）提高胶乳中黄色体的稳定性，导致排胶时间延长，胶乳产量增加。该观点认为由于割胶改变了乳管的渗透压，引起胶乳中对渗透压敏感的黄色体破裂，并释放出对橡胶粒子有絮凝活性的阳离子，使得胶乳发生絮凝和凝固，从而堵塞割口影响排胶，而乙烯利刺激能降低胶乳中黄色体破裂指数，导致排胶时间延长，胶乳产量增加。如前人通过对乙烯利刺激前后橡胶树胶乳进行等密度离心，结果发现乙烯利刺激前胶乳中黄色体主要分布在底层，多为破裂的或再凝集的黄色体；乙烯利刺激后胶乳中黄色体主要分布在中间层，大多数为完整无损的黄色体，而且与乙烯利刺激前相比，胶乳中黄色体破裂指数降低45%，堵塞指数降低31%［45］。（2）降低胶乳的絮凝活性。该观点认为乙烯利刺激可能影响胶乳凝集有关基因的表达模式，从而延迟胶乳凝结过程，导致排胶时间延长，胶乳产量增加［46］。众所周知，胶乳中含有凝固因子和抗凝固因子，这些因子之间的平衡对橡胶树的产量至关重要。橡胶蛋白（hevein）作为胶乳凝固的主要凝固因子，是黄色体中可溶性蛋白的最主要构成成分，约占其总量的70%［19］。当黄色体破裂时，能够释放大量的橡胶蛋白进入乳管细胞液中，与橡胶粒子表面受体的糖蛋白结合形成多价桥，从而引起橡胶粒子凝絮和乳管原位堵塞。同时，胶乳中还含有高水平的抗凝固因子——几丁质酶（hevamine），其中98%的几丁质酶位于黄色体中，它们能够竞争性的结合与凝结有关的橡胶蛋白受体位点，从而延迟胶乳凝结过程。如研究证实乙烯利刺激能够显著提高几丁质酶的表达水平，从而延缓橡胶粒子之间的絮凝作用和胶乳的凝固过程［47］。此外，乙烯利刺激还能促进活性氧（activated oxygen species，AOS）的产生，使得过氧化物累积与活性氧清除失衡，黄色体破裂并释放凝固因子，胶乳原位凝固，致使排胶停止。但研究发现乙烯利刺激却能增加AOS清除相关酶类基因的转录水平，这些基因的表达与黄色体稳定性和胶乳絮凝密切相关。如Miao等［48］证明乙烯利处理后，橡胶树中编码锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）的两种基因在胶乳细胞中过量表达，表明Mn-SOD在乙烯利刺激橡胶树增产起着重要的调节作用。吴瑞等［49］研究证实乙烯利和过氧化氢处理均能诱导胶乳中金属硫蛋白基因HbMT2的表达，体外实验证实HbMTZ2具有清除活性氧自由基的功能，与黄色体的稳定和胶乳絮凝相关。（3）乙烯利刺激能扩大橡胶树的排胶影响面，从而提高胶乳产量。如前人观察到乙烯利刺激后橡胶树的排胶影响面不仅限于割面，而且可使排胶影响面延伸至树干2 m的高度［50］。Tungngoen等［51］发现施用乙烯利后，橡胶树树皮中水通道蛋白相关基因HbTIP1和HbPIP2的表达模式发生改变，使得乳管与周围组织之间的水循环得以改善，排胶影响面扩大，胶乳产量增加。庄海燕等［52］研究表明乙烯利处理橡胶树后，水通道蛋白基因HbPIP1 和 HbPIP2 的表达具有明显的时效性，而且两者的表达量在乙烯利处理 6 h后达到最高，与增加乳管膨压和排胶影响面，协调橡胶树韧皮部的水循环平衡密切相关。

2.3.3 乙烯信号转导与乳管发育的关系及其作用机制 在橡胶树中，乳管是由韧皮部的形成层细胞分化而来的多细胞管状组织。由于橡胶树的韧皮组织具有较大的膨压，切割树皮后胶乳排出。割胶和乙烯利刺激相当于某种程度的胁迫处理，能够促进乳管中天然橡胶的合成。同时，研究表明机械损伤以及与割胶相关的渗透压调节都能诱导橡胶树中内源乙烯和茉莉酸的合成［18，53］。此外，机械损伤和外源茉莉酸处理还能促进幼龄橡胶树茎秆树皮中次生乳管细胞的分化［54，55］，表明乙烯和茉莉酸在乳管分化和胶乳代谢过程中都起着重要的调控作用。

在胶乳代谢相关基因的转录调控水平，诸多研究表明外源乙烯处理可以诱导乳管发育的多个生物学过程，诸如蔗糖卸载［56］、水分吸收［27］、营养同化或防御蛋白的合成［57］，该过程涉及大量ERF基因的表达［27，58］，表明乙烯利刺激橡胶树增产与乙烯信号转导通路相关基因的表达密切相关。在基因的转录水平与转录后调控水平，ERF不仅能够激活或抑制下游一系列乙烯响应相关基因的表达，而且ERF还是多种信号通路的交叉控制节点［59］。在橡胶树胶乳代谢和次生乳管发育中，ERF作为乙烯和茉莉酸信号通路的交叉调控节点，能将乙烯信号通路与茉莉酸信号通路整合在一起，协同调控乳管发育的多个生物学进程，该过程涉及大量的ERF基因的表达［60］。如研究证实ERF1作为乙烯和茉莉酸信号通路的转录激活位点，能够调节橡胶树体内大量乙烯和茉莉酸响应相关基因的表达［18］。因此，考虑到乙烯和茉莉酸在调控乳管发育中的关键性作用，ERF极有可能在橡胶树乳管分化和形态学建成过程中起到信号转导的桥梁作用。

2.3.4 miRNA与产排胶的关系及其作用机制 近年来，关于miRNA与激素响应因子间的互作研究取得了长足进展，这些研究结果表明植物的生长发育过程很大程度上受到miRNA与激素行为的相互调控。因此，洞悉橡胶树响应乙烯利刺激相关miRNA及相关靶基因的种类，将有助于确定相关功能性miRNA及其靶基因在胶乳代谢、乳管发育及乙烯信号转导中的重要性，为进一步深入揭示橡胶树响应乙烯利刺激的分子机理奠定了良好基础。

在胶乳代谢相关基因的转录后调控水平，诸多研究证实miRNA通过多种方式广泛参与了胶乳代谢、乳管分化及乙烯信号转导过程，它们是胶乳代谢过程中不可缺少的重要组成部分。如Gebelin等［61］对橡胶树中响应不同激素处理与非生物学胁迫相关的miRNA进行鉴定，结果发现乙烯利处理后橡胶树树皮中hbr-miR396和hbr-miR319的表达量呈下调表达趋势；而未用乙烯利处理橡胶树树皮中hbrmiR166和hbr-miR319的表达量却呈高丰度表达，表明乙烯利处理后橡胶树树皮中miRNA的种类及其表达量呈现出不同的表达趋势。Duan等［62］通过对橡胶树中参与乙烯信号转导相关的miRNA及其靶基因进行鉴定，研究结果表明包括hbr-miR156、hbrmiR159、hbr-miR172、hbr-miR393、hbr-miR395、hbrmiR396、hbr-miR408、hbr-miR894、hbr-miR1511、hbr-miRn11、hbr-miRn12及hbr-miRn14在内的12个miRNA与乙烯信号转导密切相关，它们能够分别抑制28个HbAP2/ERF基因的表达，且相关miRNA与靶基因的作用位点均位于AP2结构域的保守区域。其中8个miRNA家族（包括hbr-miR159、hbrmiR172、hbr-miR393、hbr-miR408、hbr-miR894、hbrmiRn11、hbr-miRn12和hbr-miRn14）能够抑制30个胶乳代谢相关ERF基因的表达，暗示一些具有重要调控功能的miRNA广泛参与了橡胶树的乙烯信号转导和胶乳代谢过程。Porawee等［63］通过对乙烯利敏感型橡胶树高产无性系PB217中参与乙烯利响应相关miRNA的种类进行鉴定和功能分析，结果表明乙烯利处理橡胶树后，树皮中hbr-miR159和hbrmiR166的表达量呈显著下调表达趋势，相反hbrmiR167与hbr-miR172在树皮中的表达量却呈显著上调表达趋势。进一步对筛选到的乙烯利响应相关miRNA的靶基因进行鉴定，结果表明除hbr-miR159未能找到相应的靶基因外，hbr-miR166可以靶向HD-ZIPIII（亮氨酸拉链蛋白），hbr-miR167可以靶向ARF6/ARF8（生长素响应因子），hbr-miR172可以靶向REF3（橡胶延伸因子），这些靶基因中HDZIPIII被认为广泛参与了植物中初生与次生维管组织的形态学建成［64］；ARF6/ARF8据报道在植物的维管发育中起重要调控作用［65］，而REF3与胶乳中大橡胶粒子的合成，以及橡胶分子链的延伸密切相关［66］，推测乙烯利处理橡胶树后，树皮中hbrmiR166/HD-ZIPIII、hbr-miR167/ARF6或ARF8及hbrmiR172/REF3的表达差异，可能导致了橡胶树排胶时间延长及胶乳产量增加，在橡胶树响应乙烯利刺激的生理机制中起重要调控作用。此外，该研究结果还推测橡胶树幼嫩树皮中hbr-miR172及其靶基因REF3的负调控关系，可能导致了乙烯利敏感型橡胶树品系中胶乳产量的大量增加。同时，结果还暗示在长期的乙烯利处理中，hbr-miR167与ARF6/ARF6参与的乳管发育衰退，可能逐步导致了死皮综合症的发生。

综上所述，前人研究表明乙烯利刺激橡胶树的增产过程既与产胶有关，又与排胶有关，同时，也与乙烯信号转导密切相关（表1）。目前，关于乙烯利刺激橡胶树增产的观点主要集中在以下几个方面：（1）乙烯利刺激橡胶树后能导致蔗糖转运和代谢加速，由于蔗糖是橡胶生物合成的原料，因此认为乙烯利刺激橡胶树后蔗糖代谢加速可能是乙烯利刺激橡胶树增产的一个主要原因。（2）乙烯利刺激能够显著增加 HMGS 的酶活性及mRNA的积累，以催化乙酰乙酸辅酶A 形成HMGR，从而为橡胶的生物合成提供原料，促进橡胶增产。（3）虽然研究证实天然橡胶生物合成重要途径相关基因的表达不受乙烯利的诱导，与乙烯利刺激橡胶树增产没有直接关系，但天然橡胶合成的其他分支途径却受乙烯利刺激的显著调控，推测乙烯利刺激橡胶树增产可能通过其他生物学合成通路产生相关生物学效应。（4）乙烯利刺激橡胶树增产主要是通过加强排胶过程来实现的，其原因在于乙烯利刺激可能通过增加胶乳中黄色体的稳定性，从而延长排胶时间来实现胶乳产量的增加。（5）最新研究表明乙烯利刺激橡胶树增产不仅与乙烯信号转导通路相关基因的表达密切相关，而且一些具有重要调控功能的miRNA也广泛参与了橡胶树的乳管发育和胶乳代谢过程，它们是胶乳代谢过程中不可缺少的重要组成部分。

2.4 乙烯利刺激橡胶树增产的假说

综上所述，尽管前人已从胶乳代谢的生理生化水平、胶乳代谢相关基因的转录调控水平及转录后调控水平等角度分析了橡胶树响应乙烯利刺激的调控机制，但关于橡胶树响应乙烯利刺激的分子机制仍不明确。

目前，关于乙烯利刺激橡胶树增产机制主要有以下3种假说：（1）解除乳管堵塞假说［67］，该假说认为胶乳细胞中富含对渗透性敏感的黄色体，由于在排胶过程中胶乳发生稀释反应，导致渗透压降低，黄色体破损，并释放出二价金属离子等致凝物质，使得胶乳产生絮凝作用，引起乳管原位堵塞。而乙烯利刺激能够提高胶乳细胞中黄色体的稳定性，降低乳管的堵塞指数，延长排胶时间，从而产生增产效应。（2）诱导愈伤反应假说［68］，该假说认为与其他植物一样，橡胶树在受到伤害（如机械伤害割胶或化学伤害乙烯利刺激）之后，便会产生大量的内源创伤乙烯或应激诱导乙烯，这种乙烯可作为大幅度动员贮备物质的化学信号向周围组织传递，引起愈伤反应［69］，促使水分和养分向愈伤部位运输，从而增强胶乳再生机能和强化乳管系统的排胶作用，使得胶乳产量明显增多，形成一个大幅度增产高峰。随后因原料迅速消耗，胶乳产量又逐渐回落。（3）解除基因表达阻遏假说，该假说认为乙烯利刺激后，不仅能提高原生质膜上ATP酶的活性，使得激活的ATP酶能与蔗糖结合形成H+-蔗糖共运转，为蔗糖进入乳管的主动运输过程提供所需的能量和驱动力［70］。同时，负责液泡膜质子ATP酶合成的基因在乙烯利的作用下，处于去遏制状态，促使质子运输激活，质子流入黄色体，并诱使柠檬酸和Ca2+进入液泡，使得细胞液碱化，转化酶活性提高，加速蔗糖降解，最后促使异戊二烯的合成作用激活、加快。该假说把乙烯利刺激增产归因于释放出的乙烯解除了 H+-ATP酶合成基因的阻遏状态，从而刺激了乳管中橡胶的生物合成。目前，以上3种假说都仅能解释乙烯利刺激后橡胶树产胶和排胶过程中的部分生理现象，仍缺乏相应的分子生物学实验证据，关于乙烯刺激橡胶树增产的机理还缺乏统一的定论。此外，关于ERF基因在天然橡胶生物合成中直接作用方式仍存在很大争议，需要进一步加强相关研究。

表1 已证实巴西橡胶树中参与乙烯响应相关基因与miRNA的种类及功能

3 乙烯利刺激对橡胶树的副作用

与任何事物存在两面性一样，乙烯利使用得当，可显著提高胶乳产量，挖掘橡胶树的产胶潜力，但使用不当将使乙烯“利”转而成为乙烯“害”，导致橡胶树发生排胶线变窄、排胶线内缩、树皮发生肥肿、韧皮部坏死、伤口不易愈合、死皮等不良反应［71-73］。目前，生产中高强度割胶与过度乙烯利刺激盛行，对天然橡胶生产造成的危害与副作用已日益明显［74］，其危害与副作用主要体现在以下几个方面：（1）高频率或高浓度的乙烯利刺激使得橡胶树死皮病的发生机率加大。研究表明当乙烯利刺激浓度达10%以上时，橡胶树会出现过度长流、割面暴皮流胶、割线变褐、死皮增多等现象［75］。（2）长期施用乙烯利刺激导致橡胶树养分和水分流失严重，橡胶树生长缓慢。前人研究表明乙烯利刺激主要通过延长排胶时间来增加胶乳产量，在排胶时间延长的同时，橡胶树的养分流失量要比产量增加量大1-3倍，而且乙烯利刺激割胶后橡胶树养分流失成分不同于常规割胶，其中随胶乳流失的磷钾比例较高［76］。其次，由于乙烯利刺激后胶乳强烈稀释，导致橡胶树在较短时间内流失大量水分，尤其在干旱季节乙烯利刺激割胶带来的水分亏缺问题则更为突出。前人研究证实乙烯利刺激割胶带来的养分和水分的大量消耗，甚至能引起包括砧木在内整株橡胶树生长小环境的变化［77］，严重影响橡胶树的正常生长。（3）长期施用乙烯利容易导致割线附近树皮的衰老。长期施用乙烯利后，橡胶树割线附近水囊皮会遭受不同程度的破坏，致使水囊皮变薄、水囊皮中石细胞数量增多，进而对形成层造成伤害［78］。（4）长期施用乙烯利能导致乳管细胞中活性氧代谢的失活。研究表明长期施用乙烯利刺激能增加橡胶树乳管细胞中NAD（P）H氧化酶活性，进而产生大量的活性氧成分，使乳管细胞中活性氧的产生与清除机制失去平衡［79］，从而使胶乳细胞中黄色体破裂，胶乳原位凝固，乳管细胞丧失产胶功能。

总之，前人研究结果表明，在天然橡胶生产中，只有在贯彻管养割相结合的前提下，根据橡胶树的品系特性，采取低频、短线、少药、浅割、增肥及产胶动态分析等保护性措施和胶乳生理参数综合调控手段［80，81］，合理控制乙烯利的刺激浓度与割胶强度，使橡胶树的生产与产胶、产胶与排胶保持动态生理平衡，才能使橡胶树安全生产和持续高产及稳产。

4 展望

正确认识乙烯利对橡胶树增产的调控机制及副作用具有十分重要的实践指导意义，它不仅是降低乙烯副作用伤害，保证天然橡胶可持续发展的前提，而且也是合理指导乙烯利刺激技术，开展乙烯利精准施药，以及研制高效、低伤害的新型乙烯利刺激剂的基础。尽管前人已对橡胶树响应乙烯利刺激的生理效应进行了多角度分析，但迄今，关于乙烯利刺激橡胶树增产的分子调控机制仍然未知。

纵观近年来橡胶树响应乙烯利刺激的相关报道，与生理生化方面已取得的研究进展相比，橡胶树响应乙烯利刺激的分子调控机制研究相对滞后，有关乙烯利刺激橡胶树增产的一些问题仍需进一步深入探讨。如（1）乙烯利在橡胶树增产分子机制中所扮演的真正角色问题。（2）乙烯利刺激使得橡胶树的糖酵解产物偏离橡胶烃的合成途径，从而降低蔗糖转化为橡胶烃的效率，不利于橡胶的生物合成和橡胶质量的提高问题。（3）不同浓度乙烯利对橡胶树活性氧产生速率及抗氧化保护酶系统的影响不同，以及相关浓度乙烯利刺激后，橡胶树乳管细胞中活性氧的产生与清除的平衡问题。（4）乙烯利刺激后，乳管细胞中一些重要的细胞器、蛋白质或者基因等产生复杂变化后对胶乳代谢的影响问题。（5）不同橡胶树品系，以及不同割龄橡胶树都表现出不同的耐乙烯利刺激特性，其生理生化参数也存在一定差异。如何采用合适的乙烯利刺激浓度和方式问题，这些问题仍是研究橡胶树的乙烯生理学及乙烯利刺激增产机制的重要课题之一。

此外，考虑到乙烯利刺激割胶已成为现在割胶制度的重要组成部分，生产中耐乙烯利刺激橡胶树品系的匮乏，已成为天然橡胶产业可持续的重要限制因素，亟需进一步深入探究橡胶树响应乙烯利刺激的分子调控机制，为选育橡胶树高产、耐乙烯利刺激新品种选育提供理论依据。为此，笔者认为今后还应进一步加大以下几个方面的研究力度：（1）目前，虽然已从橡胶树中克隆出大量的乙烯响应相关基因，但由于橡胶树遗传转化体系尚不完善，相关基因的功能鉴定还有一定的困难，下一步应继续加强橡胶树遗传转化方面的研究力度，加强技术攻关，在橡胶树再生体系以及稳定遗传转化体系的建立等方面做好技术储备。（2）鉴于乙烯利刺激橡胶树增产机制的复杂性，该过程受转录水平和转录后水平多重调控，急需借助于新一代测序技术对橡胶树乙烯响应相关基因和非编码RNA进行大规模筛选，从乳管分化、产胶、排胶及胶乳再生等角度对橡胶树响应乙烯利刺激相关基因和miRNA进行系统的分类、鉴定和功能验证，从整体水平解析乙烯利刺激橡胶树增产机制的本质。此外，鉴于乙烯利刺激后，磷酸化作用，糖基化作用、异戊烯基化、胶乳生理参数pH、离子平衡及ATP的变化等都在橡胶树胶乳合成调控中起重要作用，且相关的报道和研究数据较少，需加强相关方面的研究力度。

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（责任编辑 狄艳红）

Research Progress of the Physiological and Molecular Regulation Mechanism of Hevea brasiliensis in Response to Ethephon Stimulation

WEI Ming-ming LI Wei-guo GAO Xin-sheng HUANG Xiao
（State Centre for Rubber Breeding，Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree of Ministry of Agriculture，Rubber Research Institute，CATAS，Danzhou 571737）

Application of the ethephon stimulation，as an important means to increase the yield of rubber tree， has been widely used in the production of natural rubber. However， the regulatory mechanism of rubber tree in response to ethephon stimulation is still unclear， which has become one of problems that need to be solved urgently in developing the new rubber tree stimulation agent and breeding new rubber tree varieties with ethephon stimulation resistance. This paper summarized such researches in recent years，the genes related to the ethylene signal transduction pathway of rubber tree，the biological regulation mechanism of rubber tree in response to ethephon stimulation，and the side effects of ethephon stimulation to rubber tree， aiming to provide

for deeply studying the molecular mechanism of the rubber tree in res ponse to ethephon stimulation.

Hevea brasiliensis；ethephon；regulation mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.002

2015-04-14

国家天然橡胶产业技术体系（CARS-34），农业部基本科研业务费（1630022013001）

位明明，男，博士，研究方向：橡胶树遗传育种；E-mail：rekeyuanlywmm@126.com