被神经性毒剂染毒的蛋白IgG中有机磷加合物的研究

孙凤娟，卢晓刚，高润利，王红梅，裴承新

（国民核生化灾害防护国家重点实验室 北京 1044信箱 102205）

被神经性毒剂染毒的蛋白IgG中有机磷加合物的研究

孙凤娟，卢晓刚，高润利，王红梅*，裴承新*

（国民核生化灾害防护国家重点实验室 北京 1044信箱 102205）

本文对IgG与神经性毒剂的加合物进行了研究。用过量的神经性毒剂（沙林、梭曼、VX、环沙林）对IgG（人、大鼠IgG）进行体外染毒，用胰蛋白酶进行酶解，所得样品用Q Exactive LC-MS/MS方法进行分析鉴定，发现了IgG与神经性毒剂的加合物肽段。其中，从人的IgG中发现了4个被标记的肽段，从大鼠的IgG中发现了1个被标记的肽段，另外，还从肽段的二级谱图中发现了酪氨酸加合物的特征离子碎片。本文首次发现了被神经性毒剂标记的IgG肽段，进而说明IgG是鉴定神经性毒剂中毒的一类重要的标记蛋白。

IgG，神经性毒剂，加合物

1　引言

神经性毒剂是一类可以破坏人神经系统正常传导功能的毒剂，对体内乙酰胆碱酯酶具有强烈的抑制作用［1，2］，大剂量急性中毒［3］可使人呼吸中枢麻痹而死亡［4］，小剂量慢性中毒可引起记忆力减退、学习能力退化、疲劳、抑郁以及帕金森综合症等。神经性毒剂进入人体后，除了能与乙酰胆碱酯酶作用生成加合物外，还能与其它蛋白作用生成加合物，虽然其他蛋白与神经性毒剂作用后生物体并没有中毒症状出现，但生成的加合物却能鉴定神经性毒剂的中毒。这些蛋白主要有白蛋白［5-7］、转铁蛋白［8］、微管蛋白［9］、丁酰胆碱酯酶［10，11］和各种丝氨酸水解酶等。

神经性毒剂与蛋白加合物的鉴定主要依赖于各种质谱技术，如MALDI-TOF-TOF技术［12，13］、LC-MS/MS技术［14］、UHPLC-MS/MS技术［15］。随着科技的日益成熟，超高分辨质谱越来越多地应用到加合物的检测中，因此更多的可以与神经性毒剂作用的蛋白被发现。本实验采用先进的Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统Q-Exactive LC-MS/ MS［16，17］，对经神经性毒剂（沙林、梭曼、VX、环沙林）染毒的IgG（人IgG与大鼠IgG）的胰蛋白酶酶解产物进行了分析，将得到的一级和二级高分辨质谱数据利用Discoverer 1.4软件在UNIPROT的IgG数据库中进行比对鉴定，根据精确质量数、同位素分布、二级质谱图相关性等对可能的加合物肽段进行了定性分析，发现了与神经性毒剂结合的加合物肽段。其中从人IgG中发现了4个可以生成加合物的肽段，从大鼠IgG中发现了1个可生成加合物的肽段。通过对二级质谱数据分析，确定了它们的结合位点，并通过对质谱数据手动分析，找到了沙林、梭曼、VX、环沙林几种毒剂与酪氨酸加合物的特征离子碎片，这些离子碎片对神经性毒剂位点的鉴定起到决定性作用。能与神经性毒剂作用的IgG中的加合物肽段，为本文首次发现，它为神经性毒剂中毒后的检测提供了一种新的蛋白，也为鉴定神经性毒剂抗体的研究提供了新的实验基础。图1为沙林、梭曼、VX、环沙林的结构式。

图1　沙林、梭曼、VX、环沙林的结构式

2　实验部分

2.1仪器与试剂

Q Exactive LC-MS/MS高分辨质谱系统，带有Ultimate 3000 RSLC nano液相系统，Xcalibur工作站和Proteome Discoverer 1.4软件（美国Thermo Fisher公司）； ALPHA 2-4 Christ冷冻干燥机（德国Martin Christ公司）； AS 185离心机（AS ONE株式会社）；FE20 pH计（瑞士Mettler Toledo公司）；Heidolph MR-3001K加热仪（德国Heidolph公司）；透析袋［MWCO］=8，000-14，000（北京索莱宝科技有限公司）；0.5 mL 10 kD超滤管（美国Milipore公司）。

人IgG、大鼠IgG、二硫苏糖醇、碘乙酰胺（北京索莱宝科技有限公司）；胰蛋白酶（德国Roche公司）；沙林、梭曼、VX、环沙林（本重点实验室提供）；乙腈（HPLC纯）、甲酸（德国J&K公司）；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、异丙醇等，均为市售分析纯（北京化学试剂公司）。

2.2样品的制备

将沙林、梭曼、VX、环沙林用异丙醇溶解，配成10 mg/ mL的溶液；用pH 7.4的磷酸二氢钾与磷酸氢二钾的缓冲液溶解人IgG（或大鼠IgG），配成1 mg/mL的溶液；取四份IgG溶液，每份0.25 mL，向每份IgG溶液中分别加入沙林、梭曼、VX、环沙林的溶液15 μL（神经性毒剂与IgG的摩尔比约为330-640：1），37 °C水浴过夜（16 h）；将染毒的样品用沸水煮5 min，每份加入0.25 mL 二硫苏糖醇（DTT）（DTT用25 mM的NH4HCO3溶解，浓度为10 mM）在57 °C水浴中反应1 h，之后加入0.25 mL 碘乙酰胺（IAM）（IAM用25 mM的NH4HCO3溶液溶解，浓度为50 mM）室温避光反应2.5 h；样品移入透析袋（［MWCO］=12，000-14，000）透析，透析缓冲液为10 mM NH4HCO3溶液，过夜透析，中间换缓冲液两次；移入1.5 mL的离心管，每份样品取0.4 mL，分别加入0.1 mL浓度为20 ng/μL的胰蛋白酶溶液（胰蛋白酶用25 mM的NH4HCO3溶液溶解），37 °C酶解过夜（16 h）；将样品移入0.5 mL 10 kD的超滤管，在16，000 rpm下高速离心10 min，超滤管的下层溶液则为处理完的样品溶液；将样品溶液用冷冻干燥机冻干以备进一步检测。

2.3样品的检测

快速液相色谱条件：分析柱型号为Agilent ZORBAX 300SB-C18（150 mm×75 μm，3.5 μm）；柱温为50 °C；流动相A为100%水+ 0.1%甲酸，流动相B为20%水+80%乙腈+0.1%甲酸；流动相梯度为5 min-4% B，85 min-35% B，95 min-50% B，100 min-95% B，105 min-95% B，110 min-4% B，120 min-4% B；流动相流速0.3 μL/min。

质谱参数：采用nanoESI离子化方式；电喷雾电压为2.5 kV；毛细管温度300 °C；扫描模式为Full Scan/ddMS2，采集范围为350-1800 D；分辨率采用MS Full Scan 70000 FWHM，MS/MS 17500 FWHM，HCD为27%；蛋白质搜索数据库为相应的UNIPROT库。

3.　结果与讨论

本文用神经性毒剂（沙林、梭曼、VX、环沙林）分别对人IgG与大鼠IgG过量染毒（过量摩尔数330-640倍），并用Q Exactive LC-MS/MS进行鉴定，得到了5个被神经性毒剂标记的肽段，其中人IgG中被标记的肽段有4个（修饰位点分别为酪氨酸与丝氨酸残基），大鼠IgG中被标记的肽段有1个（修饰位点为酪氨酸残基），且这五个肽段都被两种以上毒剂标记，说明在毒剂大量过量时，这五个肽段上的作用位点对神经性毒剂展现出很好的活性。

表1总结了IgG的肽段被神经性毒剂标记的结果。从表1中可以看出，被标记的肽段分别为FNWY*VDGVEVHNAK、GFY*PSDIAVEWESNGQPENNYK、S*TSESTAALGC*LVK、Y*AASSYLSLTPEQWK、GFY*PPDIYTEWK，且其对应的蛋白序列号分别为P01857、P01859、P01860、P0CG05、P20760，均为IgG的稳定区，氨基酸序列具有一定的稳定性，可以作为神经性毒剂中毒的研究对象。

图2-5分别列举了被VX、沙林、梭曼、环沙林修饰的肽段的二级质谱图，修饰位点均为酪氨酸位点。图中的文本框标记的碎片离子分别为这四种神经性毒剂的酪氨酸加合物的特征离子碎片（见表2）。214.0628 amu为VX、沙林、梭曼、环沙林的烷氧基甲基膦酸酯的酪氨酸加合物经麦氏消除发生去烷基化的离子碎片，242.0941 amu与256.1097 amu分别为VX与沙林未发生麦氏消除反应的加合物的酪氨酸特征离子碎片。这些特征离子碎片可以为鉴定VX、沙林、梭曼、环沙林的标记位点提供离子碎片信息，是鉴定酪氨酸加合物的重要特征离子碎片。

图2　被VX标记的GFY*PPDIYTEWK肽段的二级质谱图

图2为被VX标记的肽段GFY*PPDIYTEWK的二级质谱图。图中y1-y9的离子碎片可以确定肽段PPDIYTEWK的氨基酸残基顺序，离子碎片b2则包含了甘氨酸与苯丙氨酸的残基序列，b3与b2的差值为269.0839 amu ≈ 106.0184 + 163.0633=269.0817 amu（VX与酪氨酸的单体加合物的分子量），由此可以推断VX被标记在肽段GFY*PPDIYTEWK的N端起第三个氨基酸残基—酪氨酸上。文本框标记的离子碎片242.0961 amu 与214.0648 amu为VX的酪氨酸加合物的特征离子碎片，再次证明VX标记酪氨酸上。

图3　被沙林染标记的肽段FNWY*VDGVEVHNAK的二级质谱图

图3为被沙林标记的肽段FNWY*VDGVEVHNAK的二级质谱图。其三价的分子离子峰的分子质量为肽段FNWYVDGVEVHNAK与沙林的有机磷部分的加合质量之和，说明该肽段被沙林标记。y1-y10的一系列离子碎片可以确定其对应的肽段为DGVEVHNAK，b2-b4可以推测出对应的肽段为FNWY*，而b4与b3的分子质量差为283.1063 amu ≈120.0340 + 163.0633=283.0973 amu（沙林与酪氨酸的单体加合物的分子量），由此可以确定沙林标记在N端起的第四个氨基酸残基—酪氨酸上。文本框中标记的离子碎片214.0649 amu 与256.1110 amu为沙林的酪氨酸加合物的特征离子碎片，由此也可以推断沙林标记发生在酪氨酸残基上。综上，分子离子峰，y、b系列碎片、以及其加合物的特征离子碎片证明图3为肽段FNWY*VDGVEVHNAK的二级质谱图。

图4　被梭曼标记的肽段Y*AASSYLSLTPEQWK的二级质谱图

图4为被梭曼标记的肽段Y*AASSYLSLTPEQWK的二级质谱图。一系列离子碎片y1-y13可推测出其对应的肽段为ASSYLSLTPEQWK，而b2=397.2115 amu ≈ 1.0078 + 163.0633 + 71.0371 + 162.0810=397.1892 amu（被梭曼标记的离子碎片b2的理论分子量），由此可以推断出梭曼标记发生在酪氨酸残基或者丙氨酸残基上，但丙氨酸残基上没有可与梭曼发生加合作用的基团，因此推断梭曼标记发生在酪氨酸残基上。文本框中的特征离子碎片214.0646 amu直接证明了标记发生在酪氨酸残基上。图中离子碎片［M+2H］2+-C6H12与b2-C6H12分别为二价分子离子峰与b2失去嚬哪基后的离子碎片，由于梭曼的嚬哪基部分易通过麦氏消去反应失去嚬哪基，所以生成了［M+2H］2+-C6H12与b2-C6H12的离子。综上，可以确定图4为被梭曼标记的Y*AASSYLSLTPEQWK的二级质谱图，且标记发生在酪氨酸残基上。

图5为被环沙林标记的肽段FNWY*VDGVEVHNAK的二级质谱图。由碎片离子y1-y10可以判断其对应的肽段为VDGVEVHNAK，而b4与b3的分子量之差为323.1056 amu ≈160.0653 + 163.0633=323.1286 amu，由此可以确定环沙林标记发生在N端起第四个氨基酸残基上。且根据离子碎片214.0651 amu（环沙林的酪氨酸单体的加合物的特征离子碎片）可以确定环沙林标记在酪氨酸残基上。y11-C6H10为y11发生麦氏消去反应失去环己基得到的离子碎片。综上，可以得出结论，图5为被环沙林标记的FNWY*VDGVEVHNAK的二级质谱图，且标记发生在酪氨酸残基上。

图5　被环沙林标记后的肽段FNWY*VDGVEVHNAK的二级质谱图

从图2-5中可以看出，二级质谱图的离子碎片可以推测出相应的肽段以及被神经性毒剂标记的位点，对质谱图进行手动分析，还可以找到神经性毒剂酪氨酸加合物相对应的特征离子碎片。

4　结论

本文通过Q Exactive LC-MS/MS方法成功检测到了人IgG与大鼠IgG被神经性毒剂染毒的加合物肽段，从而证明了该方法的准确性。从人IgG中发现了4个加合物肽段，从大鼠IgG中发现了1个加合物肽段，它们均能被两种以上毒剂修饰。本文首次发现了被神经性毒剂染毒的IgG蛋白中的加合物肽段，说明IgG也可以作为鉴定神经性毒剂中毒的一类重要蛋白，而这些肽段也可能成为鉴定神经性毒剂中毒的一类标志物，并有可能为检测神经性毒剂抗体的研究提供基础。

不仅如此，本文还找到了一种鉴定肽段加合物的超高分辨率的检测方法—Q Exactive LC-MS/MS方法，该方法利用软件将收集到的一级质谱数据与二级质谱数据与数据库进行自动匹配分析，找到被修饰的肽段，极大的简化了数据处理流程，由于该方法具有的高分辨率特点，检测到的加合物肽段具有很高的准确性。IgG的染毒实验中的加合物肽段的成功鉴定可以证明，Q Exactive LC-MS/MS方法确实为一种可以方便、准确鉴定蛋白加合物的有效方法。

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Phosphylated Adducts from IgG Labeled by Nerve Agents

Sun Fengjuan，Lu Xiaogang，Gao Runli，Wang Hongmei*，Pei Chengxin*
（State Key Laboratory of NBC Protection for Civilian，Beijing，102205）

Adducts of IgG exposure to nerve agents were studied in the present work. Pure human IgG and rat IgG were incubated with numerous nerve agents（NA）including sarin，soman，VX，and cyclosarin，and then proteins were cleaved by trypsin. Tryptic peptides were identified by Q Exactive LC-MS/MS. Four labeled peptides were found in human IgG and one labeled peptide was found in rat IgG. Characteristic ions of tyrosine adducts were found in the MS/MS mass spectra. The NA-labeled peptides in IgG are found for the first time，so this new nerve agents-bound IgG can be used as a new labeled protein to identify exposure to NA.

IgG，nerve agents，adducts

Q51

A

10.11967/2016140404

［CLC］ Q51［Document Code］ A 10.11967/2016140404

孙凤娟：1983年1月出生，女，河北石家庄人，在读博士，助理工程师，军事有机化学方向。裴承新： 1964年1月出生，男，湖北人，研究员、博士生导师，军事有机化学方向。王红梅：1972年5月出生，女，山东郓城人，副研究员，军事有机化学方向。