低剂量氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎运动行为的影响

郭樱子，栾亚楠，周玉玲，白承连，任湘鹏

（1.温州医科大学附属眼视光医院 实验室中心，浙江　温州　325027；2.温州医科大学　环境与公共卫生学院，浙江　温州　325035）



低剂量氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎运动行为的影响

郭樱子1，栾亚楠1，周玉玲1，白承连2，任湘鹏1

（1.温州医科大学附属眼视光医院 实验室中心，浙江温州325027；2.温州医科大学环境与公共卫生学院，浙江温州325035）

目的：研究低剂量氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎运动行为的影响。方法：用0、10、20、40、80、100 μg/L的氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎进行处理，进行畸形表型及浓度效应分析。研究0、2.5、5、10 μg/L的低剂量氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎自主运动、接触反应、自由泳动等运动行为的影响。结果：氯氟氰菊酯暴毒斑马鱼胚胎的主要畸形表型为心包囊肿大、脊柱和尾部弯曲、卵黄囊肿大等。与对照组比，20 μg/L及以上浓度暴露下斑马鱼胚胎的畸形率显著提高（P＜0.05），而10 μg/L氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎无明显致畸效应。氯氟氰菊酯在胚胎受精后120 h（120 hpf）的半数致畸浓度（EC50）为38.61 μg/L。运动行为检测结果显示，2.5 μg/L暴露下斑马鱼胚胎的自主运动频率在19、21和22 hpf时显著升高（P＜0.05），10 μg/L氯氟氰菊酯暴露下胚胎的自主运动频率在20和21 hpf时显著下降（P＜0.05），且峰值由21 hpf延迟到22 hpf；5、10 μg/L组胚胎在27和48 hpf时对接触反应的运动距离呈显著下降（P＜0.05）；10 μg/L氯氟氰菊酯显著降低了仔鱼的自由泳动速度（P＜0.01）。结论：氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎有严重的致畸效应，且呈现剂量依赖性。对斑马鱼胚胎无明显致畸效应的低剂量氯氟氰菊酯即可显著影响其自主运动、接触反应、自由泳动等发育早期的运动行为。

氯氟氰菊酯；斑马鱼；胚胎发育；运动行为

拟除虫菊酯类杀虫剂是在天然除虫菊素基础上迅速发展的一类高效安全的新型农药，广泛应用于农作物及卫生害虫的防治。研究表明菊酯类杀虫剂具有神经毒性［1］，发育期的神经系统对某些特异性菊酯类杀虫剂更加敏感［2］。有报道称孕妇、儿童甚至婴幼儿尿液中均含有拟除虫菊酯类农药代谢产物［3］，提示婴幼儿在生长发育阶段也会处于低浓度水平拟除虫菊酯类杀虫剂的暴露之中。因此，有必要研究模拟环境水平的低剂量拟除虫菊酯类杀虫剂的发育神经毒性效应。

斑马鱼具有体型小、易饲养繁殖、体外受精、产卵量大、胚胎透明、发育快等独特优势，其神经系统与人类非常相似，相关基因与人类神经系统的同源基因具有高度保守性，是一种良好的发育神经毒性评价模型［4］。相对于传统的死亡、畸形等毒理学指标，神经行为学指标更加敏感特异，是发育神经毒性评价的一项重要指标［5］。斑马鱼在正常发育早期逐步出现自主运动、接触反应和自由泳动等几个稳定的运动行为特征［6］，特别适合于高通量筛选的行为学评价［7］。本研究以斑马鱼胚胎为研究对象，选择I I型拟除虫菊酯类杀虫剂的典型代表氯氟氰菊酯为受试物，考察低剂量氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎运动行为的影响，为进一步确认其发育神经毒性提供基础。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1主要试剂：氯氟氰菊酯标准品（纯度＞99%，美国Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO）（纯度＞99%，碧云天生物技术有限公司），其他试剂均为分析纯。1.1.2 实验动物：无病原体AB品系斑马鱼（引自美国Oregon州立大学）

1.1.3主要设备：全封闭斑马鱼循环养殖孵化系统（美国AHAB公司），光照恒温培养箱（RXZ-300C，宁波江南仪器厂），体式显微镜（Nikon SMZ1500，上海千欣仪器有限公司），斑马鱼行为分析系统（Video Track 3.5，法国Viewpoint Life Science公司），精密电子天平（Satorius BS124S，北京赛多利斯仪器系统有限公司），旋涡混合器（XW-80，上海医科大学仪器厂），超纯水器（UPWS-1-20T，杭州永洁达净化科技有限公司），pH计（Delta 320，上海峰至仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1斑马鱼饲养及胚胎收集：斑马鱼饲养在全封闭斑马鱼循环养殖系统中进行，早晚定时喂食盐水丰年虫幼体，中午喂食成鱼颗粒状饲料。饲养水温为（26±1）℃，pH值为6.5～7.5，光周期为14 h光照、10 h黑暗。胚胎收集前1天晚上将健康性成熟斑马鱼按雌雄1∶1配对放入孵化箱内混养，次日早上灯亮后0.5 h开始收集。胚胎收集完，经清洗、挑选后移入斑马鱼胚胎培养液中，于28 ℃光照培养箱中培养待用。按照Kimmel等［8］描述对斑马鱼胚胎发育阶段进行分期。

1.2.2氯氟氰菊酯毒液的配制及半数致畸浓度（EC50）测定：称取适量氯氟氰菊酯粉末溶于DMSO，配制成高浓度贮备液，再用DMSO分别稀释成不同浓度的母液，置于4 ℃冰箱备用。实验前，分别用胚胎培养液将不同浓度的母液稀释1 000倍，配制成染毒工作液（此工作液中的DMSO浓度为0.1%，该浓度对胚胎发育无显著影响）。参照文献［9］报道的氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎的暴露浓度，设置6个实验浓度组，分别为：0（对照组）、10、20、40、80、100 μg/L。使用96孔无菌细胞培养板作为染毒器具，每孔分别加入300 μL上述浓度的氯氟氰菊酯溶液，放入1枚经镜检发育正常的受精后6 h（6 hpf）的胚胎，并置于28 ℃光照培养箱中培养，染毒至120 hpf。每个实验浓度组用40枚胚胎。染毒期间每2 d更换毒液，加盖后用保鲜膜封好以避免实验浓度的改变。每隔24 h在体式显微镜下观察胚胎发育，挑出死亡和畸形胚胎，并记录数目。畸形胚胎包括色素发育不全、孵化不成功、脊柱弯曲、尾部弯曲、卵黄囊肿大、心包囊肿大、游囊关闭、身体侧翻、脑部坏死等。记录120 hpf时各个染毒浓度组的畸形胚胎总数（包含死亡胚胎数），畸形率=畸形胚胎数/胚胎总数。该实验用不同批次和亲本来源的斑马鱼胚胎重复4次。调用SPSS软件中的概率单位模型估算氯氟氰菊酯的EC50大小。

1.2.3自主运动分析［10］：参照氯氟氰菊酯的浓度效应分析（10 μg/L浓度对斑马鱼胚胎无致畸效应），将胚胎分为4组，分别用0、2.5、5、10 μg/L氯氟氰菊酯暴毒处理，每组20枚健康胚胎。染毒方法同上。自主运动记录在室温27～28 ℃下适应5 min后进行，在装有CCD的体式显微镜下录像，记录从18 hpf至25 hpf（每小时记录1次）1 min内斑马鱼胚胎的自主运动（表现为尾部自主的左右摆动），计数。实验重复3次。

1.2.4 接触反应分析［11］：染毒方法同上。以氯氟氰菊酯浓度为0、2.5、5、10 μg/L进行暴露染毒，每组20枚健康胚胎。在27和48 hpf时期，用专用小针轻轻碰触斑马鱼尾部背侧，进行接触反应实验，以对接触刺激做出逃生反应的胚胎运动的距离为终值进行比较。实验重复3次。

1.2.5运动活力分析［10］：挑选正常发育的6 hpf阶段的胚胎，分别加入到含不同浓度氯氟氰菊酯（0、2.5、5、10 μg/L）的96孔板中，每孔300 μL毒液及1枚胚胎，每组24枚健康胚胎。光照培养箱中暴毒培养到96 hpf后，在显微镜下观察仔鱼的发育情况，将无明显畸形及其他行为异常的个体经胚胎培养液漂洗，脱毒后转入到有新鲜培养液的24孔板中，每孔2 mL 培养液及1个仔鱼，恢复培养至120 hpf，用于运动活力分析。检测前在体视显微镜下观察仔鱼的游囊及发育行为和运动姿势是否正常（异常个体行为不纳入统计范围）。仔鱼在行为分析仪Zebrabox中适应10 min后，在Tracking模式下检测仔鱼自由泳动，运动活力检测时间为20 min。实验重复3次。

1.3统计学处理方法 采用SPSS16.0统计软件进行分析，数据作图采用GraphPad Prism 6软件完成。实验数据以±s的方式给出，方差齐性检验采用Levene检验，多组样本均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较方差齐者采用LSD Least-significant dif-ference）检验，方差不齐者进行Kruskal-Wallis检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎发育的畸形效应氯氟氰菊酯暴毒斑马鱼胚胎中普遍存在的畸形效应为心包囊肿大、脊柱和尾部弯曲、卵黄囊肿大、身体侧翻等，见图1A。暴露于氯氟氰菊酯的胚胎在120 hpf时的畸形率具有剂量依赖效应，即与暴露浓度成正比（见图1B）。与对照组相比，20 μg/L及以上浓度暴露下斑马鱼胚胎的畸形率显著提高（P ＜0.05），100 μg/L暴露下斑马鱼胚胎的畸形率增加到（87.50±6.21）%（P＜0.01），10 μg/L氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎无明显致畸效应。概率单位法估算氯氟氰菊酯的EC50=38.61 μg/L，95%置信区间为31.84～46.71 μg/L。

图1　氯氟氰菊酯染毒斑马鱼胚胎120 hpf时的畸形表型及剂量效应分析

图2　低剂量氯氟氰菊酯染毒斑马鱼胚胎在18～25 hpf时期1 min内自主运动次数（n=20）

2.2低剂量氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎自主运动的影响 对照组胚胎18～21 hpf期间自主运动频率逐渐增加，而在21～25 hpf期间自主运动频率逐渐下降（见图2）。在18 hpf时自主运动频率为3.02± 0.38，在21 hpf时达到峰值7.48±0.59，而在25 hpf时又下降至3.84±0.28。与对照组相比，2.5μg/L暴露下斑马鱼胚胎的自主运动频率在18～23 hpf时均表现为上升趋势，在19 hpf时显著升高至4.98±0.28（P＜0.05），21 hpf时的高峰值显著升高至8.48±0.63（P＜0.05），22 hpf时显著上升至6.12±0.56（P＜0.05）；而在24～25 hpf时的自主运动频率略微下降。与之相反，10 μg/L氯氟氰菊酯暴露下胚胎的自主运动频率在18～21 hpf时均较对照组表现为下降趋势，20 hpf时显著下降至4.81±0.56（P＜0.05），21 hpf时显著下降至4.96±0.38（P＜0.05）；值得注意的是，10 μg/L氯氟氰菊酯暴露下，胚胎的自主运动频率高峰值由21 hpf延迟到22 hpf，且高峰值降至6.02±0.65。5 μg/L氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎18～25 hpf期间的自主运动频率无明显影响。

2.3低剂量氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎接触反应的影响 与对照组相比，暴露于各个低浓度氯氟氰菊酯的胚胎在27、48 hpf时对接触反应的运动距离基本呈下降趋势，见图3。在27 hpf，对照组胚胎对接触反应的运动距离为78.48±14.19，而5、10 μg/L组胚胎的运动距离显著下降至49.38±7.96 （P＜0.05）和24.16±6.42（P＜0.01）；在48 hpf，对照组对接触反应的运动距离为158.79±25.32，而5、10 μg/L组胚胎则显著下降至81.31±15.63 （P＜0.01）和73.25±12.46（P＜0.01）。2.5 μg/L氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎的接触反应无明显影响。

图3　低剂量氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎接触反应的影响（n=20）

2.4低剂量氯氟氰菊酯对斑马鱼仔鱼运动活力的影响 6～96 hpf期间暴露于低剂量氯氟氰菊酯的胚胎，在120 hpf的仔鱼运动活力见图4。对照组仔鱼自由泳动的平均速度为（1.96±0.14）mm/s，2.5、5、10 μg/L组的平均运动速度分别为2.06±0.22，1.68±0.30和1.41±0.14（P＜0.01），10 μg/L氯氟氰菊酯显著降低了仔鱼的自由泳动速度。

图4　低剂量氯氟氰菊酯染毒下斑马鱼仔鱼自由泳动的平均速度（n=24）

3　讨论

随着拟除虫菊酯杀虫剂的使用量不断增加，其潜在的人体健康风险问题越来越受到关注，特别是对婴幼儿等敏感人群神经发育的影响。Demicco等［9］首次利用斑马鱼模型研究了6种菊酯类农药的发育神经毒性。本研究结果进一步表明，对斑马鱼胚胎无明显致畸效应的低剂量氯氟氰菊酯（10 μg/L）即可显著影响其自主运动、接触反应、自由泳动等发育早期的运动行为，提示低剂量菊酯类杀虫剂具有潜在的发育神经毒性。

本研究发现，在发育早期（6～120 hpf）暴露于氯氟氰菊酯导致斑马鱼胚胎出现一系列畸形表型，多种畸形效应往往同时出现在较高浓度染毒组，各组畸形效应在72 hpf时开始出现，到120 hpf时畸形率增加。本研究中畸形表型分析与其他学者的研究结果基本一致，如王健等［12］发现，在48 hpf以后，经高效氯氰菊酯溶液处理的胚胎会表现出不同程度的毒性反应，包括体轴弯曲、心包囊肿、独眼和死亡，在0.1 mg/L浓度下，畸形率显著增加。徐永学等［13］研究发现氯氰菊酯暴露组斑马鱼胚胎在24 hpf前形态上未出现明显异常，48 hpf以后表现出体轴弯曲、心包囊肿等不同程度的毒性反应症状。另外，本研究的剂量效应分析表明，10 μg/L氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎发育无明显影响，为后续研究氯氟氰菊酯的低剂量效应提供了准确的浓度设置范围。由于我们采用96孔板进行暴露和培养，避免了胚胎之间的交叉感染等因素，因而剂量结果更加准确可靠。

本研究重点考察了低剂量氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎运动行为的影响，以此来间接反应其发育神经毒性效应。胚胎尾部的自主运动是斑马鱼发育的初期运动特征，运动信号直接由脊椎神经元传出而不经过脑部神经［6］。17 hpf时，功能神经元与体节相连接，斑马鱼胚胎开始自主运动，而后随着运动神经系统的发育，这种非神经中枢控制的运动就逐渐减少［14］。与之一致，本研究中对照组胚胎从自主运动发生开始，到21 hpf时该运动频率达到一个峰值，再逐渐减少。本研究结果还显示低剂量氯氟氰菊酯暴露可改变斑马鱼的自主运动频率，表现为2.5 μg/L暴露可显著上调19、21、22 hpf期的自主运动；而10 μg/L暴露则显著抑制20～21 hpf期的自主运动，且10 μg/L染毒组胚胎自主运动到达峰值的时间延迟了1 h，表明低剂量氯氟氰菊酯对胚胎发育有短时间的抑制作用，这可能与躯干肌肉或神经支配异常有关［14］。其他研究学者也报道过类似的研究结果，如Jim等［15］研究发现，不同浓度的联苯菊酯染毒可显著提高斑马鱼胚胎24 hpf期的自主运动频率，这与本研究中2.5 μg/L氯氟氰菊酯暴露对胚胎自主运动的影响相似。Huang等［10］利用斑马鱼胚胎研究了全氟辛烷磺酸的行为毒性效应，结果表明对照组胚胎在18 hpf时自主运动能够达到峰值，而全氟辛烷磺酸染毒组的峰值延迟1至2 h，同样说明其对胚胎发育有短暂抑制效应。对发育中的哺乳动物的神经行为效应研究表明，菊酯类农药可特异性作用于电压敏感钠离子通道而导致神经毒性［2］，其对斑马鱼胚胎自主运动的影响是否由于通过靶向钠离子通道而引起尚需进一步研究。

在斑马鱼的发育过程中，胚胎对于接触刺激的反应开始于21 hpf，在27 hpf时得到进一步的发育完善［6］，它被认为是斑马鱼逃避反应的发育开端。接触反应是在斑马鱼尾部受到刺激后，Rohon-Beard感觉神经元迅速兴奋，引起脊柱运动神经元及其支配的肌肉纤维的共同作用下产生的运动行为［16］。本研究表明，5、10 μg/L氯氟氰菊酯处理组斑马鱼胚胎在27、48 hpf时接触反应的运动距离显著低于对照组。其他不同化合物对斑马鱼胚胎接触反应的影响也有过类似报道，如有研究表明，与对照组相比，四溴双酚A染毒组斑马鱼在27、36、48 hpf时的接触反应能力显著降低［11］。不同浓度的雷帕霉素暴露对斑马鱼胚胎的接触反应能力有显著影响，低浓度表现为促进，而高浓度表现为抑制［17］。Rohon-Beard感觉神经元迅速进入活化状态是接触反应的细胞基础，多种神经毒物的暴露可引起斑马鱼Rohon-Beard感觉神经元的发育缺陷［18］。因此，本研究中低剂量氯氟氰菊酯的暴露可能引起早期发育期斑马鱼Rohon-Beard感觉神经元的损伤，使其对尾部的刺激变得迟钝，导致其对接触刺激无法做出迅速反应。菊酯类杀虫剂对斑马鱼胚胎接触反应相关神经元的损伤作用及机制尚需深入研究。

正常发育的斑马鱼仔鱼在96～120 hpf阶段开始陆续出现张开的游囊组织，由卵黄囊提供营养和能量，使其具有自由泳动的能力，其运动能力也最能反应环境污染物质对机体造成的代谢，神经及肌肉等组织或器官功能的毒性［5］。为了进一步研究低剂量氯氟氰菊酯对于斑马鱼神经行为的影响，我们考察了在光照条件下20 min内仔鱼的平均运动速度。结果表明，10 μg/L氯氟氰菊酯暴露即可显著降低仔鱼的自由泳动速度。与本研究类似，Jim等［15］研究了不同浓度的联苯菊酯对斑马鱼仔鱼运动活力的影响，结果表明，3～84 hpf时期暴露于50、100、200 μg/L联苯菊酯的斑马鱼胚胎，在96 hpf时期的运动活力呈显著下降。而值得注意的是，Huang等［10］的研究表明，自6 hpf染毒至96 hpf后脱毒的仔鱼，第5天的泳速随浓度的升高呈“倒U型”，而仅仅在144 hpf时染毒1 h的仔鱼，泳速随浓度升高而升高，这种效应在其他几种神经毒物中也同样出现［19］。相对长时间染毒导致的仔鱼运动活力下降与肌肉组织受损及神经肌肉协调性阻断有关［20］，因此，本研究中10 μg/L氯氟氰菊酯较长时间暴露可能损害了斑马鱼胚胎的肌肉组织与其神经肌肉的协调性，其具体神经机制还需要进一步研究。

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（本文编辑：赵翠翠，丁敏娇）

Effect of low-dose cyhalothrin on motor behavior in zebrafi sh embryos

GUO Yingzi1, LUAN Ya’nan1, ZHOU Yuling1, BAI Chenglian2, REN Xiangpeng1. 1.Laboratory Center, the Eye Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.School of Public Health and Environment, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To study the effects of low-dose cyhalothrin on motor behavior in zebrafish embryos. Methods: The dose-response effects and malformation phenotype were evaluated by observing zebrafi sh embryos exposed to different concentrations of 0， 10， 20， 40， 80， 100 μg/L cyhalothrin solutions. The impact of low-dose of 0， 2.5， 5， 10 μg/L cyhalothrin on several motor behaviors in zebrafi sh embryos was then explored，including embryonic spontaneous movement， touch response and larval swimming speed. Results: The predominant malformation phenotypes observed in surviving embryos were edema of pericardialsac， bent spine， curved tail and yolk sac edema. Compared with the control group， zebrafi sh embryos exposed to 20 μg/L and above concentrations showed signifi cantly increased malformation rate （P＜0.05）， while 10 μg/L cyhalothrin exhibited no infl uence on embryonic development. Cyhalothrin concentration that led to 50% malformations （EC50） of the embryos at 120 hours post fertilization （hpf） was 38.61 μg/L. A series of motor behavior tests revealed that embryos exposed to 2.5 μg/L cyhalothrin displayed remarkably elevated spontaneous movement frequency at 19， 21 and 22 hpf （P＜0.05）， while this frequency was decreased in embryos treated with 10 μg/L cyhalothrin at 20-21 hpf （P＜0.05）； besides， 5， 10 μg/L cyhalothrin exposure induced markedly reduction of touch response movement in zebrafi sh embryos at both 27 and 48 hpf （P＜0.05）； moreover， 10 μg/L cyhalothrin reduced larval swimming movement speed at 120 hpf （P＜0.01）. Conclusion: Cyhalothrin causes severe embryonic toxicity in a dosedependent manner. Low dose of cyhalothrin exposure which shows no effect on embryonic development signifi -cantly alters several motor behaviors at early life stage.

cyhalothrin； zebrafi sh； embryonic development； motor behavior

R994.6

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.07.002

2016-01-18

国家自然科学基金资助项目（31101680）；温州医学院科研启动项目（QTJ09019）。

郭樱子（1993-），女，湖北仙桃人，硕士生。

任湘鹏，副研究员，Email：renxpeng@wmu.edu.cn。