多元福利措施改善巴马小型猪福利状况的实验评价

胡　樱, 杨　斐（复旦大学实验动物科学部, 上海200030）

多元福利措施改善巴马小型猪福利状况的实验评价

胡樱, 杨斐
（复旦大学实验动物科学部, 上海200030）

目的研究多元福利措施（组合应用音乐、香薰、营养、玩具、生物活性垫料等环境丰富元素）对实验小型猪整体福利状况的综合改善作用。方法将来自6窝的12头雌性巴马小型猪（每窝2头）分别编入常规饲养组和优化饲养组饲养9周，测定两组的应激分子表达、免疫平衡、血常规指标和生长情况。结果相比于常规饲养组，优化饲养组具有更低的皮质醇水平和干扰素-γ/白细胞介素-4比值，糖皮质激素受体（GR） mRNA和热休克蛋白70 （HSP70） mRNA表达更少，红细胞数（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞比容（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、白细胞数（WBC）、中性粒细胞（NEUT）和嗜酸性粒细胞（EO）较高。结论采用多元福利措施的优化饲养有助降低日常饲养中小型猪的应激水平，提高抗应激能力，同时可引起免疫平衡和血常规指标相应改变。

实验用小型猪； 应激； 环境丰富

小型猪因其独特的生物学特性以及在实验操作和饲养管理等方面的便利性，近年来在生命科学领域和生物医药行业备受青睐，其实验应用日益广泛，但对实验用小型猪的日常饲养管理多沿袭畜牧业中经济动物的模式和观念，既难以满足动物实验研究对实验用小型猪饲育的特殊要求，也未能从实验动物的角度考虑小型猪的福利需求。不同于肉用猪福利技术侧重于育肥技术以及如何降低运输和屠宰时的应激，实验用小型猪福利技术主要关注如何降低其日常饲养应激和实验操作应激［1］。本研究根据小型猪感官发达、情绪丰富的生物学特性，运用动物福利原理探索了整合有玩具、音乐、香薰、营养和生态垫料的多元福利措施对改善实验用巴马小型猪整体福利状况的作用及其潜在机制，以期为实验用小型猪的福利评价和干预技术的研究应用提供科学依据。

1　材料与方法

1.1实验动物

普通级雌性巴马小型猪12头, 体质量10±1 kg,江苏省吴江田宇生物科技有限公司提供（种源来自广西巴马原产地）［SCXK（苏）2011-0001］，饲养于普通级环境［SYXK（苏）2015-0035］。

1.2主要仪器和试剂

IDEX ProCyte Dx全自动五分类动物血细胞分析仪及配套试剂包；ABI Vii7 PCR仪；DNM-9602酶标仪；GE LAS4000膜芯片检测仪；猪皮质醇ELISA kit（LDN）； Porcine Cytokine Array Q1 kit（Biotnt）；trizol （invitrogen）, M-MLV （promega），Recombinant Rnasin （promega）, cDNA第一链合成试剂盒（Biotnt），PCR master mix （Biotnt）； 引物采用oligo和primer5设计并由invitrogen公司合成，β-actin上游引物：5'-TCCTCTCTTGCCTCTCTTTG-3'； β-actin下游引物：5'-CACGAGCCAGTGTTAGTACC-3'； 糖皮质激素受体（GR）上游引物：5'-CGAATGTGAAGGGTCAGACT-3'； GR下游引物：5'-CTCCAAATGTCAAAGGTGCT-3'； 热休克蛋白70（HSP70）上游引物：5'-ATGCCACCATCCCTAC-AAAG-3'； HSP70下游引物：5'-GCCCTCTCACCC-TCATACA-3'。

1.3分组与处理

1.3.1分组12头小猪分别选自6窝，每窝2只，分别编入优化饲养组和常规饲养组, 每组6头。编组后给予2周适应期按常规饲养, 无任何处理。2周后, 对优化饲养组应用多元福利措施（音乐、香薰、玩具、营养、生态垫料组合应用）, 常规饲养组继续按常规饲养, 无任何实验处理。实验时间9周。

1.3.2常规饲养组的处理动物饲养于铺设常规水泥栅格地面的圈舍内，每天上午8∶00～9∶00、下午14∶00～15∶00分别按0.5 kg/头给予小型猪配方饲料，采用自动饮水装置24 h连续供水，无其他处理。

1.3.3优化饲养组的处理在优化饲养组圈舍地面铺设厚度为50 cm的成熟生态垫料（含75 m3锯末与100 kg预混益生菌制剂）, 圈内放入直径20 cm的塑胶皮球1个, 悬挂铁链3根, 每日上午8∶00～9∶00饲喂时，按动物体质量的0.15%将预制营养干预剂粉剂（红景天提取物∶沙棘提取物∶灵芝提取物∶枸杞子提取物为1∶1∶1∶1）均匀掺入饲料中供自由采食，饲喂结束后，以无序循环方式播放音乐2 h（55 dB），乐曲选自BANDARI轻音乐（african meditation，allegia，annies wonderland，blue agoon，breath of the wind，childhood memory，ield of tears，moning air，mother nature，the yinstrels tale）； 同时开启香薰炉2 h, 每次使用0.1 mL精油（组分包括伊兰、甜橙、广藿香、花梨木提取物）。其他饲养操作同常规饲养组。

1.4指标测定

实验期间每周测量动物体质量，实验结束后所有动物以电击致晕后经颈静脉采血10 mL，其中1 mL全血采用EDTA-2K抗凝后仪器法测定血液学指标, 其余9 mL全血于室温（20～22 ℃）静置30 min,再于4 ℃环境中 3 000 r/min离心分离血清, ELISA法测定血清皮质醇（Cortisol）含量, 采血后立即无菌解剖采集每头猪的心脏、肝脏、肾脏和脾脏组织各一份（约200 mg/份）, 芯片法测定白细胞介素-4（IL-4）、干扰素-γ（IFN-γ）含量，实时荧光PCR法测定心脏、肝脏、肾脏、脾脏组织中GR mRNA和HSP70 mRNA水平。

1.5数据处理

2　结果

2.1血清中激素和细胞因子含量

优化饲养组皮质醇、IFN-γ以及IFN-γ/IL-4 比值均低于常规饲养组（P＜0.05）（表1）。

表1　血清应激激素与细胞因子含量（n=6）

2.2GR mRNA表达水平

优化饲养组的心脏、肾脏和肝脏中的GR mRNA均低于常规饲养组（P＜0.05）（图1）。

2.3HSP70 mRNA表达水平的测定

优化饲养组心脏、肾脏和肝脏中的HSP70 mRNA均低于常规饲养组（P＜0.01）（图2）。

2.4血常规指标

与常规饲养组比较, 优化饲养组红细胞数、血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞容积及白细胞数、中性粒细胞数和嗜酸性粒细胞数均较高（P＜0.01）,平均红细胞血红蛋白量也较高（P＜0.05），红细胞分布宽度较低（P＜0.05）（表2）。

2.5动物生长曲线测定

优化饲养组和常规饲养组间体质量增长无显著性差异（图3）。

图1　GR基因在小型猪不同脏器中的表达

图2　HSP70基因在小型猪不同脏器中的表达

表2　小型猪血常规指标测定

图3　实验期间小型猪生长曲线

3　讨论

本研究显示，接受多元福利措施的小型猪不仅血清中的皮质醇水平较按常规饲养的更低，其心、肾、肝、脾中应激相关基因（GR和HSP70）的表达水平也更低。该结果从机体应激的核心效应分子角度提示该优化饲养有利于实验小型猪在日常生活中维持较低的整体应激水平。根据动物福利原理，尽管生活在标准化环境中的常规饲养动物未接受任何实验处理，单调贫瘠的圈舍陈设也会形成刺激缺失”应激原，这正是环境丰富技术的理论基础［2］。“刺激缺失”主要通过两种途径损害动物福利：一是阻止动物表达天性，二是降低动物对环境变化的适应性。天性行为是动物保持正常生理和心理状态所必需的一些行为，诸如磨爪、磨牙、自我修饰、探索、玩耍、相互梳理等天性行为看似和生存无必然联系，却有助于动物释放情绪和建立良好社会关系，因此一旦环境中缺乏完成这些天性的条件，动物就会因为情绪的积累或社交障碍而引发焦虑、孤独、乏味等应激状态，常此以往易导致动物生理和心理异常，生存质量下降。由于目前的实验动物标准化饲养环境中通常缺乏足够的设施、器材供动物表达天性，由此导致“刺激缺失”普遍存在。本研究根据小型猪好奇、好动、好拱等心理和行为特征及其对环境多样化的需求［3］，提供松软的发酵锯末为垫料替代常规的水泥地面，满足其翻拱探索的习性［4］，并提供悬垂铁链和塑胶球满足其拖拽、推顶的玩耍需求［5］，有效丰富了环境构成，一定程度上弥补了缺失的刺激，同时，该垫料能为小型猪躺卧时提供舒适环境，缓和冲突，减少清理圈舍带来的不适和应激［6］。其二，鉴于适度的环境改变有利于动物保持合理的警惕，以便随时微调生存策略和行为模式等，以更小的生物学代价完成适应过程，本研究针对小型猪听觉和嗅觉敏锐、偏好甜食的特点，采用饲喂后定时播放节奏舒缓并具有自然鸟鸣、风声、水声的轻音乐丰富听觉环境，定时采用具有舒缓安抚效果的天然精油香薰丰富其嗅觉环境，以及在饲料中添加补气生血且口感微甜的天然药食同源食材制成的营养干预剂丰富饲料口感，这些元素与圈舍陈设相结合，营造了一个覆盖多种感官、满足多重生理需求且具有适度变化的多元化丰富饲养环境，通过长期反复的微弱新异刺激上调动物应激响应阈值，由此提高其对环境变化的耐受性和适应性。再者，本研究所选择的音乐、精油和营养干预剂本身亦可单独发挥一定的缓解机体应激、调理脏腑机能、提高机体适应性的作用，通过组合应用，更可有效降低小型猪应激本底。

IFN-γ/IL-4 比值的变化显示优化饲养的小型猪免疫平衡比常规饲养略向辅助性T细胞1（Th1）偏转。免疫平衡是构成内稳态的重要因素，通过Th1型和Th2型细胞因子的相互作用维持机体细胞免疫和体液免疫的平衡，在感染、自身免疫病、肿瘤等疾病状态以及妊娠等特殊生理状态中，都存在Th1/Th2偏移［7］，但机体应激对免疫平衡的影响目前尚无定论，结合应激分子的变化特点，本研究结果提示常规饲养中的背景性应激可能使小型猪的免疫平衡发生Th2偏移，多元福利措施具有纠正该偏移的潜在效果。

两组的血细胞成分在红、白两系细胞都存在差异。红细胞是体内主要负责运送氧气和养分的血细胞, 除遗传因素外和机体营养状况关系密切, 优化饲养组红系细胞多个指标比常规饲养组略高，该结果与优化饲养小型猪利用更大活动空间和道具表现出更多运动、以及营养干预剂的补益作用相吻合。同时, 相对于常规饲养组, 优化饲养组循环中存在更多嗜酸性粒细胞, 该结果也与其血清中较低的皮质醇水平吻合。此外, 鉴于生态垫料中作业菌群在分解排泄物的同时为小型猪提供了一个多菌的环境, 优化饲养小型猪中性粒细胞的增加推测与此有关。

本研究运用针对实验小型猪听觉、触觉、嗅觉、味觉等感官特点设计的环境丰富元素并采用组合实施多种福利措施的手段，通过比较生活在“丰富”或“贫瘠”环境中的同胎小型猪在应激生物学指标和常规生理指标的差异，研究了多元福利措施对实验小型猪整体福利的改善作用及其潜在机制，结果表明该多元福利措施可有效缓解小型猪在常规饲养中所存在的紧张和不适，降低应激本底，与此同时作为应激联动指标的部分免疫学和血液学指标也会发生相应改变。基于环境丰富原理的动物福利措施的设计和应用，关键在于客观评估其福利效应以及对机体基准值的影响［8,9］，该研究提示，在福利效应方面，多元福利措施具有降低小型猪日常应激本底从而提高实验小型猪福利的确切效果和推广应用价值，而在指标基准值方面，由于日常饲养应激普遍以应激本底的形式存在于动物实验研究中，当改善动物福利的效应表现为降低动物应激本底时，必然引起部分免疫指标、生理生化指标等基准值的改变，对此需要结合实验动物生物学特性和实验具体内容分析，从而通过修正基准值为为实验提供更科学结果判读依据。

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Study on the Benefits of Multi-welfare Strategies in Minipigs

HU Ying, YANG Fei
（Department of Laboratory Animal Science， Fudan University， Shanghai 200032， China）

ObjectiveTo study improvements in well-being of minipigs with multi-welfare strategies （combine with music, aromatherapy oils, nutrients, toys, biological activity bedding）. MethodsTwelve female Bama minipigs from 6 litters were used in this study, while every 2 pigs from the same litter were divided separately into conventional group and optimized group. After 9 weeks’ rearing, the expression of stress-related molecules, immune balance, blood parameters and growth performance were measured. ResultsPigs from optimized group display lower serum cortisol level and lower IFN-γ/IL-4 as well as lower expression in GR mRNA and HSP70 mRNA, meanwhile their RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, WBC, NEUT and EO were observed higher than those from conventional group. ConclusionMultiwelfare strategies is benefit to reduce stress lever of minipigs and enhance their anti-stress ability, meanwhile, it can also change the immune balance and blood routine.

Minipig； Stress； Environmental enrichment

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0121-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.008

2015-10-21

上海市科技发展基金项目（12140900900）

胡樱（1973-）, 女, 高级实验师, 研究方向： 实验动物福利与比较医学。E-mail： secrethy@126.com

杨斐, 男, 副研究员, 研究方向： 比较医学与实验动物应用。E-mail： yfdwbfd@fudan.edu.cn