奥曲肽对局灶性脑缺血的保护作用

丁　雷, 王守宝, 宋鹤杰, 王　晔（上海儿童医学中心, 上海200127）

奥曲肽对局灶性脑缺血的保护作用

丁雷, 王守宝, 宋鹤杰, 王晔
（上海儿童医学中心, 上海200127）

目的观察奥曲肽（OCT）对局灶性缺血再灌注的保护作用并探讨相关作用机制。方法80只SD大鼠随机分为4组，分别为假手术组，缺血再灌注组，OCT低剂量组及OCT高剂量组。在建立缺血再灌注模型各组分别使用安慰剂或OCT处理。参照Longa 5分制评分标准，分别在再灌注后的各观察时间段对大鼠进行神经功能评分； 脑组织标本分别采用氯化三苯基四氮唑（TTC）染色进行梗死面积检测，并采用试剂盒检测丙二醛（MDA）和过氧化物歧化酶（SOD）含量。结果高剂量OCT能够显著改善脑缺血再灌注组大鼠的功能评分。OCT高剂量组动物梗死面积明显小于缺血再灌注组（P＜0.05），MDA在OCT高剂量组的活性分别显著低于缺血再灌注组（P＜0.05），而SOD的活性OCT组则显著升高（P＜0.05）。结论OCT在大鼠脑缺血再灌注具有保护作用，可能是通过影响脑部的氧化来产生作用的。

奥曲肽（OCT）； 缺血再灌注； 梗死面积； 过氧化物歧化酶（SOD）； 丙二醛（MDA）

缺血性脑损伤是影响人类的身体健康的重要疾病之一，其具有发病率、致残率、死亡率及复发率高的特点［1］，因此，有效预防和控制该疾病具有重要意义。目前，脑缺血的治疗措施主要采用早期溶栓来保护急性期的神经功能，该方法被认为无法有效地改善缺血性损伤所致的长期病理损伤［2］。奥曲肽（OCT），是一种合成的环状八肽，先前研究［3］认为其能够通过抗炎症及抗氧化效应来治疗急性胰腺炎和视网膜及肠道的缺血再灌注损伤。然而其在局灶性脑缺血中的效应仍不明确。

本文采用改良的Longa线栓法［4］建立大鼠脑缺血再灌注模型, 采用OCT治疗后，通过对大鼠进行神经功能评分、氯化三苯基四氮唑（TTC）染色观察脑梗死情况以及检测脑组织中丙二醛（MDA）和过氧化物歧化酶（SOD）水平，探讨OCT在脑缺血过程中的可能的保护作用，继而为其可能在临床上的治疗提供基础。

1　材料与方法

1.1动物与分组

清洁级雄性SD大鼠80只，体质量210～260 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司［SYCK（沪）2012-0002］，饲养于仁济医院清洁级设施［SYXK（沪）2011-0121］，实验过程中动物的饲养和取材均遵守实验动物管理与保护的有关规定。SD大鼠随机分为假手术组（Sham）（n=20）、脑缺血再灌注模型组（MACO）（n=20）、低剂量OCT组（OCT-L）（n=20）及高剂量OCT组（OCT-H）（n=20）。

1.2大鼠脑缺血再灌注模型制作

根据Longa等［4］所描述的方法建立大鼠脑缺血模型。步骤如下： 将动物称体质量后采用体积分数3%戊巴比妥钠40 mg/kg进行麻醉，采用仰卧位对动物进行固定，脱毛膏脱毛后采用碘伏消毒颈部皮肤。切开皮肤后分离左侧颈总动脉、颈外及颈内动脉。在颈总动脉近心端及颈外动脉进行结扎后，将栓线在颈总动脉、分叉处近心端1 mm处插入到颈总动脉，将栓线经颈内动脉送至颅内，栓线插入深度约为距离颈内及外动脉分叉约18 mm处，Sham组插线深度约为13 mm，随后将切口缝合，将线头留置于体外, 90 min后进行再灌注时, 轻轻提拉插线, 有阻力时提示栓线头端已达颈总动脉切口处, 实现再灌流。术中术后室温控制在25～27 ℃,视动物状况注射速尿或抗生素预防脑水肿和感染。所有大鼠均采用相同的饲料喂养, OCT-L和OCT-H组在脑缺血后分别立即腹腔注射50 μg/kg和100 μg/kg的OCT, Sham组和MACO组注射相同剂量的生理盐水。

1.3采集样本

各组大鼠在给药后24 h，体积分数3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉起效后，断头器断头，经枕骨大孔开颅，取出脑组织，采用生理盐水进行清洗，冠状位视交叉前后约2 mm处取少量脑组织用于后续实验。

1.4神经功能评分

参照Longa［4］5分制评分标准, 分别在模型建立后24 h进行神经功能评分。0级, 无神经损伤症状；1级, 提尾时右前肢内收屈曲, 不能完全伸展； 2级，爬行时向右侧旋转、划圈； 3级，站立时向右侧倾倒； 4级，无自主活动伴意识障碍； 5级, 死亡。

1.5脑部水容量

在模型建立24 h，各组大鼠分别用体积分数3%戊巴比妥钠腹腔注射深度麻醉，断头取脑（整个过程需快速），用滤纸吸干大脑表面水分和血液。取患侧大脑半球在干燥的器皿中进行称量，计为湿重。随后将脑半球放入电热干燥箱中（120 ℃）进行烘干，称量后计为干重并计算脑水含量［=（湿重-干重）/湿重×100%］。

1.6TTC染色

在模型建立的24 h时间点在将各组大鼠的脑组织迅速取下后将左室切成2 mm左右组织片，采用质量分数1%TTC（磷酸缓冲液配制）溶液37 ℃避光孵育20 min，拍照。按照正常心肌为鲜红色，梗死心肌为白色进行梗死面积的定量。

1.7MDA和SOD测定

取脑组织制备组织匀浆，采用试剂盒（南京建成生物制品公司）测其MDA和SOD含量，所有操作按照厂商提供的说明书进行。

1.8统计学方法

所有统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行。定量数据以均数±标准差（± s）表示, 多组间及两组间比较分别采用单因素方差分析（One way-ANOVA）及Student t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1高浓度OCT能够减弱神经功能缺陷

在MCAO模型建立后，采用5分制的方法检测了神经功能缺陷。与MACO组相比，OCT-H组大鼠的神经功能缺陷积分显著下降（P＜0.05, 表1），而OCT-L组与MCAO组无显著差异。

表1　大鼠神经功能缺陷积分

2.2高浓度OCT能够减弱脑水肿

在模型建立后24 h, 假手术组脑部水容量为78.94%±0.40%。与MACO组（86.93%±0.51%）相比，OCT-L组（84.78%±0.93%）和OCT-H组（83.36%±0.96%）在缺血半球的脑水含量均有显著下降（P＜0.05）。

2.3高浓度的OCT能够显著降低脑梗死体积

在假手术组未观察到梗死情况, 而MACO组的条纹和侧面皮质均存在广泛的损伤。高剂量OCT能够显著降低梗死体积（P＜0.05，表2和图1），OCT-L组与MCAO组不存在显著差异。

表2　大鼠脑梗死体积分析　　　　　　%

2.4OCT处理对MACO大鼠SOD和MDA活性

影响

对脑皮质组织中的SOD和MDA的活性进行检测来评价缺血24 h后氧化应激反应。与MACO组相比，无论是高剂量还是低剂量的OCT能够显著增加SOD的活性，并降低MDA的生成（表3）。

3　讨论

本研究中，高剂量OCT能够显著改善MACO小鼠的功能评分。OCT高剂量组大鼠脑梗死面积明显小于缺血再灌注组（P＜0.05）。MDA在OCT高剂量组的活性显著低于缺血再灌注组（P＜0.05），而SOD的活性OCT组则显著升高（P＜0.05）。结果显示，OCT在大鼠脑缺血再灌注中具有保护作用，可能是通过影响脑部的氧化产生作用。这些结果为今后临床应用提供实验依据。

MCAO是一种经典的用于研究脑部缺血损伤的机制的动物模型［5］。在脑缺血发生后的几分钟内,脑部组织先后出现细胞毒性应答、氧化应激、炎症应答、细胞死亡及神经损伤［6,7］。氧化应激和炎症应答被认为是脑部缺血性损伤的基本机制。因此，抗氧化和抗炎症的药物被认为具有潜在的治疗效应, 这些药物能够对缺血性损伤产生保护作用［8］。

OCT被认为能够在多种疾病中减轻氧化及炎症损伤，然而有关OCT在缺血性中风中的效应目前知之甚少。由于OCT为水溶性，其在生理条件下通常难以通过血脑屏障。尽管如此，有报道［9］认为在脑梗或脑肿瘤时会出现血脑屏障紊乱的情况，这就使OCT能够进入到受影响的区域。本文结果显示，在缺血性中风后输入OCT能够有效减轻神经功能失调、减少脑梗死的体积和脑水肿。

MDA为脂质过氧化的产物，是氧化应激的标志物，其表达水平反映了脂质过氧化的速率和范围，也代表了氧自由基的清除能力。研究［10］显示，在缺血大脑中MDA水平显著增加，而OCT能够明显抑制MDA的水平。该结果表明OCT能够通过清除自由基来减轻氧化应激，同时减少脂质过氧化的程度。SOD作为一种内源性的抗氧化酶，在机体的氧化和抗氧化平衡中具有重要作用。本研究通过检测脑皮质组织中的SOD和MDA的活性证实了OCT能够通过上调内源性抗氧化酶来减轻缺血性中风的抗氧化应激。

综上所述，本文结果显示OCT在大鼠脑缺血再灌注中具有保护作用，可能是通过影响脑部的氧化产生作用。

图1　OCT处理MACO大鼠脑梗死体积观察

表3　大鼠SOD和MDA活性水平

［1］Donnan GA, Fisher M, Macleod M, et al. Stroke［J］. Lancet, 2008, 371（9624）：1612-1623.

［2］Du Y, Zhang X, Ji H, et al. Probucol and atorvastatin in combination protect rat brains in mcao model： Upregulating peroxiredoxin2, foxo3a and nrf2 expression［J］. Neurosci Lett, 2012, 509（2）：110-115.

［3］Jingmin O, Xiping Z, Chun W, et al. Study of dexamethasone, baicalin and octreotide on brain injury of rats with severe acute pancreatitis［J］. Inflamm Res, 2012, 61（3）：265-275.

［4］Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke, 1989, 20（1）：84-91.

［5］Yang C, Zhang X, Fan H, et al. Curcumin upregulates transcription factor nrf2, ho-1 expression and protects rat brains against focal ischemia［J］. Brain Res, 2009, 1282：133-141.

［6］Liu Y, Zhang XJ, Yang CH, et al. Oxymatrine protects rat brains against permanent focal ischemia and downregulates nf-kappab expression［J］. Brain Res, 2009, 1268：174-180.

［7］Simonyi A, Wang Q, Miller RL, et al. Polyphenols in cerebral ischemia： novel targets for neuroprotection［J］. Mol Neurobiol, 2005, 31（1-3）：135-147.

［8］Cui L, Zhang X, Yang R, et al. Neuroprotection of early and short-time applying atorvastatin in the acute phase of cere-bral ischemia： Down-regulated 12/15-lox, p38mapk and cpla2 expression, ameliorated bbb permeability［J］. Brain Res, 2010, 1325：164-173.

［9］Schaalan MF, Nassar NN. Effects of octreotide in chronically mild stressed rats： possible role of immune and oxidative stress pathways［J］. NeurochemRes, 2011, 36（10）：1717-1723.

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Protective Effects of Octreotide on Cerebral Ischemia-reperfusion Injury in Rat

DING Lei, WANG Shou-bao, SONG He-jie, WANG Ye
（Shanghai Children’s Medical Center， Shanghai 200127， China）

ObjectiveTo observe the effect of octreotide （OTC） on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats and explore the related mechanism. MethodsEighty SD rats were randomly divided into 4 groups which were sham group, middle cerebral artery occlusion （MACO） group, low dosage OCT （OCT-L） and high dosage OCT （OCT-H） group. All the rats were treated with OCT or placebo immediately after establishing the MACO model. Neurologic examination was clinically performed on each rat after reperfusion according to the Longa’s scoring method. The brain tissues were then harvested and tested with triphenyltetrazolium chloride staining. The malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD） activity of brain was also tested. ResultsCompared with MCAO group, OCT significantly alleviated neurological deficit, lessened infarct volume （P＜0.05）. The activity of MDA were decreased significantly in the OCT treated group than MACO group （P＜0.05）, but the SOD increased significantly in the OCT-H group than MACO group （P＜0.05）. ConclusionOCT treatment generated protective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.

Octreotide（OCT）； Ischemia-reperfusion injury； Infarction area； Superoxide dismutase（SOD）；Malondialdehyde （MDA）

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0113-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.006

2015-12-10

新华集团基金（12Xj2208）

丁雷（1984-）, 男, 实验师。E-mail： dingleipang@163.com

王晔（1982-）, 男, 助理研究员。E-mail： ye.wang@live.cn