绿色荧光裸小鼠睾丸组织学观察及精子质量检查

胡文娟, 方　天, 刘　彪, 梁　磊, 赵志刚, 贾春梅, 陈　莉, 许龙祥, 恽时锋（南京军区南京总医院比较医学科, 全军实验动物科普与伦理教育基地, 全国科普教育基地, 南京 210002）

绿色荧光裸小鼠睾丸组织学观察及精子质量检查

胡文娟, 方天, 刘彪, 梁磊, 赵志刚, 贾春梅, 陈莉, 许龙祥, 恽时锋
（南京军区南京总医院比较医学科, 全军实验动物科普与伦理教育基地, 全国科普教育基地, 南京 210002）

目的探讨绿色荧光裸小鼠繁殖率低下的原因。方法对绿色荧光裸小鼠的睾丸及附睾进行组织病理学及精子质量检查。比较雄性绿色荧光裸小鼠与BALB/c裸小鼠的睾丸、附睾脏器系数和精子浓度、精子活力、活率及精子畸形率； 观察睾丸及附睾组织病理学变化。结果雄性绿色荧光裸小鼠及BALB/c裸小鼠的睾丸、附睾脏器系数、精子浓度及组织结构并无显著差异（P＞0.05）； 但精子活力（直线运动和原地转动及静止不动）的构成比、活精子率及畸形率间均具有显著差异（P＜0.05）。结论雄性绿色荧光裸小鼠精子质量（活力、活率及畸形率等方面）略为低下可能是影响绿色荧光裸小鼠繁殖性能的原因之一。

绿色荧光； 精子浓度； 精子质量； 繁殖性能

绿色荧光裸小鼠是本科室将绿色荧光蛋白GFP）基因导入BALB/c 裸小鼠而得来。GFP现已成为细胞生物学和分子生物学中应用最广泛的分子标记之一。绿色荧光裸小鼠因自身含有标记蛋白与普通裸小鼠相比而具有明显的优势。但在日常繁育中, 发现绿色荧光裸小鼠与普通裸小鼠相比较, 繁殖性能较为低下，平均生产胎次及窝产仔数均低于普通裸小鼠。为查明其繁殖性能低下的原因, 作者对雄性绿色荧光裸小鼠与BALB/c裸小鼠的睾丸及附睾组织、精子质量进行检测与比较，结果如下。

1　材料与方法

1.1实验动物

分别取8～10周龄SPF级雄性绿色荧光裸小鼠及普通BALB/c裸小鼠各10只，绿色荧光裸小鼠由本科室提供［SCXK（苏）2012-0014］, BALB/c裸小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司［SCXK（苏）2011-0003］），实验动物均置于无菌条件下饲养, 自由饮食, 物品严格灭菌处理, 保持一定的温度与湿度。

1.2方法

1.2.1睾丸、附睾的脏器系数测定取动物称体质量后，用水合氯醛（4%）进行麻醉，以0.2 mL/20 g腹腔注射，常规解剖后分离睾丸、附睾，及时称重并记录，并计算脏器系数［脏器质量（mg）/体质量（g）］。

1.2.2精子计数取一侧附睾置于含生理盐水的小烧杯中剪开，用镊子轻轻搅动，使精子游离，用擦镜纸过滤后加入3 mL生理盐水（经37 ℃水浴锅预温）制成精子悬液。吸取二次稀释的精子悬液，滴加于计数板与盖玻片接触处，使精液自然流入计数室中，按红细胞计数法，进行精子计数。

1.2.3精子活力检测参照文献［1］方法，在光学显微镜下观察悬液中精子的活动度, 连续计数200个精子。精子活动分3级（直线向前运动、原地转动和静止不动）。检测并计算精子活力。

1.2.4精子畸变率检测将精子悬液涂片，自然干燥, 体积分数4%甲醇固定，2%伊红染液染色1 h,冲洗晾干。高倍镜下作精子形态分析，每只小鼠涂片3次，每次500个精子，统计出其所含的畸形精子数，计算畸形率。

1.2.5睾丸及附睾病理组织学观察取一侧睾丸及附睾经常规HE染色制成病理标本片，在光学显微镜下观察组织病理学变化。

1.3统计学处理

2　结果

2.1睾丸及附睾脏器系数

两组雄性绿色荧光裸小鼠及BALB/c裸小鼠睾丸、附睾的脏器系数无显著差异（P＞0.05）（表1）。

2.2精子计数、精子活力及畸形率

由表2可知，与BALB/c裸小鼠比较，绿色荧光裸小鼠的精子浓度略有降低（P＞0.05）； 直线运动和原地转动的构成比下降，而静止不动的构成比上升（P＜0.05）； 两组裸小鼠的活精子率和畸形率均具有明显差异（P＜0.05）。绿色荧光裸小鼠与BALB/c裸小鼠精子畸形观察见图1、2。

2.3睾丸及附睾组织病理学观察

光学显微镜下可见，绿色荧光裸小鼠睾丸曲细精管排列致密有序，结构完整，曲细精管直径与生精小管上皮的厚度正常，支持细胞与各级生精细胞形态及数量未见明显异常，精原细胞近圆形,胞核较大, 管腔内可见精子, 睾丸被膜正常（图3A）。BALB/c裸小鼠睾丸曲细精管生长良好, 生精细胞排列整齐, 层次清楚, 结构正常, 有明显管腔, 细胞数量多，细胞形态未见异常（图3B）。绿色荧光裸小鼠附睾上皮细胞排列紧密，主细胞胞质饱满, 管腔内有大量精子, 未见异常（图3C）。BALB/c裸小鼠附睾上皮细胞排列有序, 管腔面有细长静纤毛, 腔内可见大量精子（图3D）。由此可见, 绿色荧光裸小鼠睾丸及附睾组织结构并未发生病理变化, 与BALB/c裸小鼠的睾丸及附睾组织结构相似, 并未查见明显改变。

表1　绿色荧光裸小鼠睾丸系数、附睾系数检测

表2　绿色荧光裸小鼠附睾精子密度和精子质量的检测

图1　BALB/c裸小鼠精子畸形（HE×200）　

图2　绿色荧光裸小鼠精子畸形（HE×200）

3　讨论

绿色荧光蛋白小鼠的启动子为β-actin, 它在维持细胞结构、细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要作用，因而绿色荧光蛋白也可以随着细胞的分裂而表达［2］。肖红卫等［3］研究表明，绿色荧光蛋白并未随绿色荧光蛋白小鼠的传代而发生明显消退。李甫强等［4］研究表明，在绿色荧光蛋白小鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）原代培养中，当BMSCs传5代时在荧光显微镜下仍带有绿色荧光表达，说明在传代过程中绿色荧光蛋白基因能稳定表达。

本实验对雄性绿色荧光蛋白裸小鼠与BALB/c裸小鼠的精子, 精子发生部位（睾丸）, 以及精子发育、成熟部位（附睾）进行了观察与相关检测。结果显示,雄性绿色荧光蛋白裸小鼠及BALB/c裸小鼠的睾丸、附睾脏器系数并无显著差异（P＞0.05）； 雄性BALB/c裸小鼠精子浓度比绿色荧光蛋白雄性裸小鼠略高, 但差异无统计学意义（P＞0.05）； 雄性绿色荧光蛋白裸小鼠精子的直线运动和原地转动的构成比较BALB/c裸小鼠均有所下降, 而静止不动的构成比略有上升, 数据之间差异具有统计学意义（P＜0.05）； 雄性绿色荧光蛋白裸小鼠的活精子率明显低于雄性BALB/c裸小鼠的活精子率（P＜0.05）； 雄性绿色荧光蛋白裸小鼠精子畸形率较高，与雄性BALB/c裸小鼠差异明显P＜0.05）。光镜下可见, 绿色荧光蛋白裸小鼠与BALB/c裸小鼠的睾丸及附睾组织结构并无明显差异。由检测数据分析, 显示雄性绿色荧光蛋白裸小鼠的睾丸、附睾脏器系数及睾丸、附睾的组织结构并未对其繁殖性能造成显著的影响, 其精子活力、活率及畸形率等方面水平低下更有可能影响了绿色荧光蛋白裸小鼠的繁殖性能, 从而使其繁殖性能下降。研究表明，日常繁育中绿色荧光蛋白裸小鼠的繁殖率较BALB/c裸小鼠低下，可能是由于雄性绿色荧光蛋白裸小鼠的精子质量（活力、活率及畸形率等方面）有所下降，影响了其生殖功能。

图3　裸小鼠睾丸及附睾组织病理学观察

［1］余同辉, 吴人亮, 甘亚平, 等. 三苯氧胺对小鼠精子的毒性作用［J］. 华中科技大学学报： 医学版, 2006, 35（1）：107-109.

［2］夏来新, 程汉华, 郭一清, 等. 黄鳝β-actin基因的克隆及其在鱼类中的系统发生分析［J］. 遗传学报, 2005, 32（7）：689-695.

［3］肖红卫, 郑新, 刘中华, 等. 绿色荧光蛋白基因转基因小鼠传代中的生物学观察［C］. 第15次全国动物遗传育种学术讨论会论文集.陕西杨凌： 中国畜牧兽医学会, 1999：209.

［4］李甫强, 周鸿鹰, 羊惠君, 等. 差速贴壁法纯化分离绿色荧光转基因小鼠骨髓间充质干细胞［J］. 四川大学学报： 医学版, 2006, 37（2）：301-304.

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0126-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.009

2015-10-12

胡文娟（1990-）, 女, 技师, 从事裸小鼠的育种与科研。E-mail： 452665670@qq.com

恽时锋（1965-）, 男, 教授, 从事医学实验动物学。E-mail： yunshifeng1@163.com