茎点霉生物学特性研究

杨玲玉，王颖，程颖慧，高瑞芳，许青，何邦令*，刘会香*

1.山东农业大学植物保护学院，山东泰安2710002.深圳出入境检验检疫局，广东深圳5180453.济宁市兖州区林业局，山东兖州272100

茎点霉生物学特性研究

杨玲玉1，王颖2，程颖慧2，高瑞芳2，许青3，何邦令1*，刘会香1*

1.山东农业大学植物保护学院，山东泰安271000
2.深圳出入境检验检疫局，广东深圳518045
3.济宁市兖州区林业局，山东兖州272100

茎点霉（Phoma spp.）是农作物和其他经济作物的重要病原菌，寄主范围广泛，引起植株叶斑、叶枯、茎枯、褐斑、枯斑等症状，其中部分种是检疫性植物病原菌。本文对茎点霉的12个种21个菌株的培养性状及分生孢子器特征进行比较研究，发现茎点霉菌株在生长速度、产孢等方面有显著差异，其中检疫性豌豆脚腐病菌（Phoma pinodella）种内菌落形态也有较大差异。大部分茎点霉菌株在燕麦培养基上明显地促进孢子产生；在PDA培养基上变温处理培养30 d，能够促进豌豆脚腐病菌菌株产孢；单一的划破菌落法对所有菌株产孢没有影响。口岸检疫时不能只依据形态学特征区分检疫性茎点霉，应结合其他分子手段综合鉴定。

茎点霉属；培养性状；分生孢子器；生物学特性

检疫性茎点霉（Phoma spp.）是农作物和经济作物的重要病原菌，寄主范围极为广泛，危害豆科、十字花科、茄科等几十属上百种植物，可引起植株叶斑、叶枯、茎枯、褐斑、枯斑等症状［1，2］，轻则导致产量下降品质变劣，重则导致植物死亡［3］。2009年，上海出入境检验检疫局从来自澳大利亚的油菜籽样品中截获了油菜茎基溃疡病菌（Leptosphaeria maculans）［4］；2012年，宁波检验检疫局从来自意大利的苹果种苗中首次检出葡萄茎枯病菌（Phoma glomerata）［5］，2013年上海口岸也从进口大豆中检验到该病菌［6］。上述检疫性Phoma病菌目前在国内尚无分布，而我国每年从别国进口大量农副产品，Phoma病菌传入的风险不断加剧。因此，掌握检疫性Phoma病菌的生物学特性，并进行科学识别和鉴定，对进境农副产品上Phoma病菌的检验检疫显得尤为重要。本文以我国口岸获取和来自荷兰微生物菌种保藏中心（CBS）的检疫性Phoma属真菌豌豆脚腐病菌（P.pinodella）、葡萄茎枯病菌（P.glomerata）、大葱抗粉根病菌（P.terrestris）、维管束茎点霉（P.tracheiphila）、油菜茎基溃疡病菌（P.lingam）和非检疫性Phoma属真菌多喙茎点霉（P.multirostrata）、热带茎点霉（P.tropica）、豌豆茎点霉（P.pinodes）、苜蓿茎点霉（P.medicaginis var.medicaginis）等1 2个种共21个菌株为试验菌株，研究了病菌的培养学特性、子实体形成所需的营养条件、子实体的形态特征及病菌生长等方面的生物学特性，研究结果对于科学检测和预警口岸检疫性Phoma病菌的入侵具有重要指导意义。

1　材料与方法

1.1供试材料

1.1.1供试菌株共计12个种21个菌株，见表1。

表1　本研究供试菌株Table 1 Isolatesof Phoma spp.in this study

1.1.2培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）进行菌株培养。PDA培养基、燕麦培养基（OA）和松针培养基进行菌株促产孢培养。

1.2菌株培养学及生长特性研究

选取培养5 d的供试Phoma菌株，挑取相同菌龄菌饼（d=5mm）接种于PDA培养基中央，于28℃恒温箱内培养5～7 d。观察菌株的培养学特性，描述菌落特征；采用十字交叉法测定菌落生长情况。试验重复3次，比较不同菌株生长速率。

1.3菌株促产孢培养

选用PDA、OA和松针三种通用培养基、变温处理、划碎菌落三种不同处理方式，研究对Phoma真菌产孢的影响。

2　结果与分析

2.1Phoma菌株在PDA培养基上的菌落特征

通过对12个种21个Phoma菌落观察表明，不同种及同种不同菌株的菌落表现丰富的多样性。

豌豆茎点霉（Phoma pinodes）共两个菌株CBS285.49和CBS235.55。菌落生长均缓慢，白色、棕黄色，辐射状，致密。生长后期两者差异较大。CBS285.49菌落白色棉絮状，中央突起，形状不规则圆形，气生菌丝发达，随着生长渐变为淡棕色或棕黄色。CBS235.55菌落轮纹明显且呈深浅交替，中央棕色，突起，圆形，白色，气生菌丝不发达，有少量绒毛状菌丝。

豌豆脚腐病菌（Phoma pinodella）共三个菌株CBS567.97、CBS100.580和2013PC69。其菌落均致密，规则圆形，无气生菌丝或气生菌丝不发达，不同培养批次菌落特征不稳定，偶会从中间形成放射状沟。CBS567.97菌落初期呈粉色绒毛状，中部红棕色，边缘棕色，随着生长颜色逐渐变深，出现明显深浅交替。CBS100.580菌落中间呈深棕色，边缘颜色浅；背面中部黑色，边缘棕色及棕黄色。匍匐生长，中部突起，凸起处菌丝棉絮状，后期菌丝间产生致密的黑色小点。2013PC69菌落棕色、墨绿色，放射状，边缘白色，后期表面出现白色菌丝团，中部少量墨绿色气生菌丝掺杂有白色气生菌丝。该菌株形态变异大，部分中央有沟壑状凹沟。

图1　检疫性Phoma菌株及非检疫性菌株在PDA培养基上的菌落特征（7 d）Fig.1Quarantine Phoma and unquarantine isolates colony characterson PDA culturemedium（7 d）

葡萄茎枯病菌（Phoma glomerata）共五个菌株CBS287.76、CBS293.36、2015SOU03、2015SOU26 和2015SOU49。其初期菌落边缘菌丝均为白色，后期表现为不同程度的棕色，中部颜色较四周深。气生菌丝不发达、平伏、致密，生长速度快，边缘规则圆形，易产生致密的轮纹状排列的分生孢子器。后期CBS287.76、CBS293.36菌落表面可溢出浅玫瑰红色油滴状的孢子堆。

热带茎点霉（Phoma tropica）（菌株3.9385）菌落边缘白色，中间墨绿色，致密，气生菌丝不发达，菌落圆形，表面绒毛状，偶有浅色扇形区域。

大葱抗粉根病菌（Phoma terrestris）（菌株ATCC36564）菌落边缘淡黄色，中间红棕色，圆形，气生菌丝较少，匍匐向基内生长，致密，生长缓慢。生长后期，菌落背面深红色，中部颜色深，易形成不规则的浅紫红色块状斑和圆点特征。

维管束茎点霉（Phoma tracheiphila）（菌株ATCC38206）菌落棕色，边缘整齐，生长缓慢，平伏，无气生菌丝，表面呈油脂状，光滑，菌落内部有不规则的深红色小点，后期为红棕色，背面中部为深棕色，周围浅棕色，内有不规则深色小点。

苜蓿茎点霉（Phomamedicaginis var.medicaginis）（菌株ACU01-1）菌落浅黄色，生长较慢，绒毛状，边缘不整齐，后期中央灰色，边缘黑色，致密，辐射状，气生菌丝较发达。

多喙茎点霉（Phomamultirostrata）（菌株3.7936）菌落中部白色，四周乳黄色，后期颜色逐渐变深，呈乳黄色，中部略突起，致密，平伏，绒毛状，边缘规则圆形，无气生菌丝，常有规则辐射状或不规则沟壑，后期易产生乳黄色分生孢子器。

Phoma sp.（菌株P77、2012PC37和SC74）三菌株菌落特征差异大，其中P77菌落初为淡黄色，后为灰褐色，夹杂白色菌丝，致密，生长缓慢，边缘呈绒毛辐射状，背面黄色；2012PC37菌落浅黄色，边缘匍匐状、不规则，生长慢，中央突起，后期背面易产生少量小黑点；SC74菌落红棕色，中部突起，气生菌丝发达，絮状，致密，边缘不整齐，出现粉色环带。背面红棕色，且深浅颜色交替，呈轮纹状。

油菜茎基溃疡病菌（Phoma lingam）共三个菌株CBS275.63、CBS260.94和CBS147.24。菌株间差异性较小，边缘规则圆形，放射状，生长速度快。CBS275.63和CBS260.94菌落白色，气生菌丝发达、茂密、棉絮状，中部凸起。CBS275.63后期出现大量轮纹状排列的黑色分生孢子器。CBS260.94中部不规则凸起，随着生长颜色变深，凸起变高，周围形成凹环。CBS147.24与上述菌株差异大，淡黄色，菌丝匍匐，气生菌丝少，具少量绒毛，基内生长。

比较热带茎点霉（Phoma tropica）（3.9385）和豌豆脚腐病菌（P.pinodella）（2013PC69），其菌落中部均为墨绿色、圆形、气生菌丝茂盛，但前者边缘白色，颜色略浅，易产孢，后者边缘无色透明，不易产孢。其它两个豌豆脚腐病菌（CBS567.97、CBS100.580）菌株形态特征各不同，生长速度快，不同批次培养菌落特征不稳定；比较油菜茎基溃疡病菌（P.lingam）（CBS275.63、CBS260.94、CBS147.24）和多喙茎点霉（3.7936），前者菌落呈白色或淡黄色，表面平整，而多喙茎点霉菌落白色，表面有沟壑状凹陷。

2.2不同菌株的生长特性测定

图2　不同Phoma菌株的生长速度Fig.2Grow th ratesof different Phoma spp.isolates

图2表明，在PDA培养基上，供试菌株种间菌丝生长速度差异很大，但种内生长差异不大。豌豆茎点霉、维管束茎点霉、苜蓿茎点霉生长速度慢。豌豆脚腐病菌、葡萄茎枯病菌生长速度快。油菜茎基溃疡病菌种内菌株生长速度差异大。

2.3Phoma不同菌株的子实体特征

2.3.1不同培养基对菌株产孢的影燕麦培养基能够促进Phoma产孢，对P.medicaginis var.medicaginis （ACU01-1）、Phoma sp.（P77、SC74）菌株促进效果明显。松针培养基对Phoma菌株促产孢效果不明显。其他菌株不产孢，需进一步摸索它们的产孢条件。

表2　供试产孢菌株子实体特征Table 2 The fruiting body characteristics of produced spore isolates

2.3.2不同培养方式对产孢的影响逆境生长条件能促进部分豌豆脚腐病菌产孢，但时间较长，一般为一月以上。CBS567.97、CBS100.580菌株在PDA上培养15～20 d后，培养皿背面会产生大量暗色小点，此时再移入4℃，逆境刺激30 d后会产生大量分生孢子（100倍物镜下）。划碎菌落对所有供试Phoma菌株产孢没有明显效果。

2.3.3部分供试Phoma菌株分生孢子器、分生孢子形态供试Phoma菌株的分生孢子器壁薄，无乳突，球形、半球形、椭圆形、近球形、不规则形，褐色或黑色（SC74呈棕红、棕黄色），部分葡萄茎枯病菌孢子器边缘颜色深，单生或聚生，生于基质表面，多数器壁外面由交织的疏松菌丝包围。分生孢子梗短。分生孢子为单孢、透明、球形、卵形、椭圆形或杆状。孢子有1～2个油球或无，P.glomerata （2015SOU03、2015SOU26、2015SOU49）和Phoma sp.（2012PC37、P77）孢子形状差别大，椭圆形、梨形或杆状，无色或浅绿色。

图3　不同菌株的分生孢子器特征（a）Phoma tropica；（b）P.multirostrata（OA）；（c）P.medicaginis var.medicaginis（松针）；（d-e）Phoma.sp.（f-j）；P.glomerata的分生孢子器Fig.3Pycnidia characteristicsof different isolates （a）Phoma tropica（b）P.multirostrata（OA）（c）P.medicaginis var.medicaginis（Pine needles）（d-e）Phoma sp.（f-j）P.glomerata of pycnidia

图4　不同菌株的分生孢子特征（A）P.Multirostrata；（B）P.medicaginis var.medicaginis；（C）P.glomerata（CBS287.76、CBS293.36）Phoma tropica；（D）Phoma sp.（SC74）；（E）P. glomerata（2015SOU03、2015SOU26、2015SOU49）Phoma sp.（2012PC37、P77）的分生孢子Fig.4Conidial characteristicsof different isolates （A）P.multirostrata；（B）P.medicaginis var.Medicaginis；（C）P.glomerata（CBS287.76，CBS293.36），Phoma tropica；（D）Phoma sp.（SC74）；（E）P. glomerata（2015SOU03，2015SOU26，2015SOU49），Phoma sp.（2012PC37，P77）

3　讨论

茎点霉属的多种病菌被中国、美国、欧盟、加拿大、日本等多国列为检疫对象。我国在2007年颁布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中，就包括了茎点霉属的Phoma pinodella （L.K.Jones）Morgan-Jones&K.B.Burch、P.glomerata（Corda）Wollenweber et Hochapfel、P.exigua desmazières f.sp.foveata（Foister）Boerema、P.tracheiphila（Petri）L.A.Kantsch.et Gikaschvili、Leptosphaeriamaculans（Desm.）Ces.etDe Not.（无性阶段为P.lingam）等。除了危害农作物，有些Phoma的种还可危害动物，甚至人类［7，8］。

茎点霉属部分真菌在我国属于检疫性病菌，尚无危害报道，其研究较少，但部分种在国外已造成严重危害。本文通过对其生物学特性研究发现，Phoma菌株生物学表现丰富的多样性，如豌豆脚腐病菌。有些种间菌落形态相似，如P.tropica和P.pinodella。对于这些菌株，口岸检疫不能单一依据形态学进行区分，应结合其他分子手段。上述检疫性Phoma菌株生物学特性的研究，有助于对口岸进境的各类植物及其产品上此类病原菌的鉴定，这对预防检疫性Phoma真菌随进境植物及其产品传入我国，保护我国种植业的安全生产具有重要意义。

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Study on Biological Characteristics of Phoma spp.

YANG Ling-yu1，WANGYing2，CHENGYing-hui2，GAO Rui-fang2，XU Qing3，HEBang-ling1*，LIU Hui-xiang1*
1.College ofPlantProtection/Shandong Agricultural University，Taian 271018，China
2.Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen 518045，China
3.Forestry Bureau ofYanzhou District，Jining City，Yanzhou，272100，China

Phoma spp.are important pathogens of crop and other econom ic crop，whose host ranges are extensive and they cause the leaf spots，leaf and stem blights，brown spot symptoms.This paper mainly studied the culture and pycnidia characters on 12 quarantine Phoma spp.of 21 related isolates.The result showed that the tested Phoma isolates had significant differences in grow ing speeds and spores production.P.pinodella among isolates was quite different in colony morphology；most of Phoma strains could obviously promote spores production on the oatmedium.P.pinodella could also produce spores in 30 days on sustainable variable temperature on PDAmedium condition.In addition，themethod of simple cutting colony had no effect on all the tested Phoma isolates spore production.Comprehensive identification of the Phoma spp in portquarantine could notonly depend onmorphological charactersbutshould combinewith othermethod.

Phoma spp.；culture characters；pycnidia；biological characteristics

S412

A

1000-2324（2016）04-0501-05

2016-03-9

2016-05-03

国家质检总局科技计划项目（2014IK008）

杨玲玉（1990-），女，山东青岛人，硕士研究生.E-mail：y928093706y@163.com

Author for correspondence.E-mail：hebangling@126.com；hxliu722@126.com