复合风味蛋白酶提取籽瓜种子蛋白工艺的优化

曹承旭，赵春燕，马　越，赵晓燕，张　超

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳　110866；2.北京市农林科学院蔬菜研究中心，果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室，农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，农业部都市农业（北方）重点实验室，北京　100097）

复合风味蛋白酶提取籽瓜种子蛋白工艺的优化

曹承旭1，赵春燕1，马越2，赵晓燕2，*张超2

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110866；2.北京市农林科学院蔬菜研究中心，果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室，农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，农业部都市农业（北方）重点实验室，北京100097）

以加酶量、酶解温度、酶解时间为影响因素，蛋白质提取率为响应值，设计三因素三水平的响应面设计优化复合风味蛋白酶提取籽瓜种子蛋白质的提取工艺。结果显示，加酶量对蛋白质提取率影响最大，其次是酶解温度和酶解时间。响应面分析模型显示，籽瓜种子蛋白质提取最佳工艺为加酶量0.22%，酶解温度59℃，酶解时间3.29 h，在该工艺下籽瓜种子蛋白质提取率为98.2%，与实际蛋白质提取率的相对偏差仅为0.80%，该模型真实可靠。

蛋白质；提取；籽瓜种子；复合风味蛋白酶

0　引言

籽瓜又名打瓜，葫芦科，一年生草本植物［1］，主要取籽炒制而食。籽瓜种子含有蛋白质、脂肪、VB 和VD等营养物质［2］，其蛋白质含量达30%～45%［3］。本项目组前期比较发现籽瓜种子中蛋白质含量高于大豆、花生和葵花籽，并且其中必需氨基酸配比比大豆更接近于FAO推荐比例［4］，因此籽瓜种子是一种优质的蛋白质资源。

酶法提取蛋白质的最大优势在于获得蛋白质资源的同时，改善蛋白质的溶解性和生理功能特性，拓宽蛋白质的应用领域［5］。本项目组前期考察了4种蛋白酶对籽瓜种子蛋白质提取率的影响，发现碱性蛋白酶提取率最高，其次是复合风味蛋白酶和中性蛋白酶［6］。但是，碱性蛋白酶在水解过程中常常会产生苦味肽［7］。而采用复合风味蛋白酶水解大豆和肉类蛋白质后，水解液中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸等支链氨基酸含量，以及谷氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸等呈味氨基酸含量丰富，未发现苦味肽［8-10］。因此，项目组以籽瓜种子为原料，利用复合风味蛋白酶提取籽瓜种子蛋白质。研究采用单因素试验结合响应面中心组和试验设计，研究酶解工艺对蛋白质提取率的影响，获得最佳籽瓜种子蛋白提取工艺，为籽瓜种子蛋白质的开发利用提供数据及理论支持。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

籽瓜种子，新疆九丰种业有限责任公司提供；复合风味蛋白酶，江苏锐阳生物科技有限公司提供。

1.2仪器与设备

RT5型加热磁力搅拌器，德国IKA公司产品；AL204型电子天平、FE20型实验pH计，METTLER TOLEDO公司产品；3-18K型冷冻离心机，德国SIGMA公司产品；FW100型万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司产品。

1.3蛋白质含量测定方法

采用凯氏定氮法测定籽瓜种子总蛋白含量；采用考马斯亮蓝方法测定提取液中蛋白质含量［11］。

1.4工艺流程

籽瓜种子去壳后利用万能粉碎机打碎，采用正己烷脱脂［12］，干燥后获得籽瓜种子脱脂粉，取20 g脱脂粉按一定料液比混合、搅拌，利用0.1 mol/LNaOH溶液调节混合液pH值，使用水浴锅控制混合液温度，当pH值与温度达到设定条件后，按照一定比例加入复合风味蛋白酶继续搅拌，同时监控水解液的pH值和温度，每30 min将混合液pH值调节至设定pH值，提取结束后迅速将混合液加热至100℃，保持5 min，然后将混合液以转速8 000 r/min离心20 min，测定上清液的体积和蛋白质含量，蛋白质提取率的计算如下。

1.5单因素试验设计

分别考察料液比、加酶量、酶解温度、酶解pH值和酶解时间对蛋白质提取率的影响。①料液比，取料液比1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，加酶量0.1%，酶解温度50℃，酶解pH值7，酶解时间3 h；②加酶量，按加酶量0.05%，0.10%，0.20%，0.30%加入复合风味蛋白酶，料液比1∶8，酶解温度50℃，酶解pH值7，酶解时间3 h；③酶解温度，按温度30，40，50，60℃进行酶解，料液比1∶8，加酶量0.10%，酶解pH值7，酶解时间3 h；④酶解pH值，按pH值4，5，6，7，8进行酶解，料液比1∶8，加酶量0.10%，酶解温度50℃，酶解时间3 h；⑤酶解时间，按时间4，5，6，7，8 h进行酶解，料液比1∶8，加酶量0.10%，酶解温度50℃，酶解pH值7。

1.6响应面试验设计

在单因素研究的基础上，选取加酶量、酶解温度、酶解时间为自变量，以蛋白质提取率为响应值，优化籽瓜种子蛋白提取工艺的最佳参数，采用SAS 9.2统计分析软件对试验数据进行分析。

响应面试验因素与水平设计见表1。

表1　响应面试验因素与水平设计

2　结果与分析

2.1料液比对籽瓜种子蛋白质提取率的影响

料液比对籽瓜种子蛋白质提取率的影响见图1。

图1　料液比对籽瓜种子蛋白质提取率的影响

由图1可知，当料液比达到1∶10之前，蛋白质提取率随着料液比增大而增大；当料液比超过1∶10之后趋于平缓。水酶法提取蛋白质过程中水量的增加对酶解有着积极的作用，但是过量的水会导致酶与底物的相对含量变少，以致酶与底物接触几率降低，酶解的作用变差［13］，所以选择料液比1∶10最为适宜。

2.2加酶量对籽瓜种子蛋白质提取率的影响

加酶量对籽瓜种子蛋白质提取率的影响见图2。

图2　加酶量对籽瓜种子蛋白质提取率的影响

由图2可知，随着加酶量的增大，酶与底物的作用就越充分，但是考虑到复合风味蛋白酶的价格较为昂贵，所以选择加酶量在0.20%时提取籽瓜种子蛋白质最为合适。

2.3酶解温度对籽瓜种子蛋白质提取率的影响

酶解温度对籽瓜种子蛋白质提取率的影响见图3。

由图3可知，随着酶解温度的增加，蛋白质的提取率逐渐增大。但是酶解温度过高可能会使酶发生变性，因而导致蛋白质提取率降低，所以当酶解温度在60℃时提取籽瓜种子蛋白质最为适宜。

图3　酶解温度对籽瓜种子蛋白质提取率的影响

2.4酶解pH值对籽瓜种子蛋白质提取率的影响

酶解pH值对籽瓜种子蛋白质提取率的影响见图4。

图4　酶解pH值对籽瓜种子蛋白质提取率的影响

由图4可知，随着溶液初始酶解pH值的增大，籽瓜种子蛋白质的提取率呈现上升趋势；当达到酶解pH值7之后呈下降趋势。说明在复合风味蛋白酶水解过程中，保持水解液的酶解pH值7最为适宜。

2.5酶解时间对籽瓜种子蛋白质提取率的影响

酶解时间对籽瓜种子蛋白质提取率的影响见图5。

图5　酶解时间对籽瓜种子蛋白质提取率的影响

由图5可知，随着酶解时间的增加，蛋白质的提取率先升高后降低，在酶解时间3 h时蛋白质的提取率达到最大。由于在水解的过程中，酶主要作用于细胞壁和原生质，使细胞原生质内的蛋白质与油一同溶出，随着酶解时间的增加，油不断地流出，使得水溶液体系中形成乳化层，最终导致蛋白质提取率降低。因此，最适的酶解时间为3 h。

2.6响应面分析方案与结果

将所得的试验数据采用SAS 9.2软件进行多元回归拟合，得到以蛋白质提取率为目标函数的二次回归方程：

Y=98.19+10.40A-9.86B+4.72C+6.57AB+8.54AC+ 9.12BC-26.90A2-30.72B2-10.14C2.

复合风味蛋白酶水解提取籽瓜种子蛋白响应面试验结果见表2，回归方程的方差分析见表3。

表2　复合风味蛋白酶水解提陬籽瓜种子蛋白响应面试验结果

表3　回归方程的方差分析

方程因变量与自变量之间的线性关系明显，该模型回归显著（p＜0.001），失拟项不显著，并且该模型R2=96.9%，R2Adj=92.8%说明该模型与试验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，试验误差小，可以用此模型来分析和预测水酶法提取籽瓜种子蛋白的结果。由此可以认为，上面给出的二次回归方程模型是合适的。由F检验可以得到因素贡献率为A＞B＞C，即加酶量＞酶解温度＞酶解时间。

加酶量和酶解温度对籽瓜种子蛋白质提取率影响见图6。

图6　加酶量和酶解温度对籽瓜种子蛋白质提取率影响

在选取的各因素范围内，通过Design Expert软件分析，图6显示不同交互作用对蛋白质提取率的影响，在试验范围内寻找蛋白质提取率最高点为加酶量0.22%，酶解温度59℃，酶解时间3.29 h，蛋白质提取率的预测值为99.0%。按最优组合方案中的提取条件进行验证试验，重复3次，取平均值，测得籽瓜种子蛋白质提取率为98.2%，与理论值99.0%接近，其相对误差为0.80%，进一步验证了数学回归模型的正确性。

3　结论

研究以加酶量、酶解温度、酶解时间为影响因子，以蛋白质提取率为响应值，结果显示加酶量对蛋白质提取率影响最大，其次是酶解温度和酶解时间；响应面分析模型显示籽瓜种子蛋白质提取的最佳工艺为加酶量0.22%，酶解温度59℃，酶解时间3.29 h，在该工艺下籽瓜种子蛋白质提取率为98.2%，与实际蛋白质提取率的相对偏差仅为0.80%，模型真实可靠。

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［13］Sajid Latif，Farooq Anwar.Aqueous enzymatic sesame oil and protein extraction［J］.Food Chemistry，2011，125：679-684.◇

Optimization of Protein Extraction from Seed of Seed-watermelon by Flavourzyme

CAO Chengxu1，ZHAO Chunyan1，MA Yue2，ZHAO Xiaoyan2，*ZHANG Chao2
（1.College of Food Science，Shenyang Agricultural Univrtsity，Shenyang，Liaoning 110866，China；2.Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences；Beijing Key Laboratory of Fruits and Vegetable Storage and Processing；Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（North China），Ministry of Agriculture；Key Laboratory of Urban Agriculture（North），Ministry of Agriculture，Beijing 100097，China）

The protein extraction from the seed of seed-watermelon by flavourzyme is optimized by surface respond experiment. The protein extraction process is optimized by the response surface of 3 factors and 3 levels.Results indicate that the enzyme amount is the key factor on the protein extraction rate，followe by enzymatic hydrolysis temperature and hydrolysis time.The optimum extraction parameters is the enzyme amount of 0.22%，temperature of 59℃，and enzyme hydrolysis time of 3.29 h. The protein extraction rate reaches 98.2%under the optimum parameters.The validation experiment proved that the surface respond model is reliable with the relative deviation of 0.80%.

protein；extraction；the seed of seed-watermelon seed；flavourzyme

TS201

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.08.011

1671-9646（2016）08a-0033-04

2016-06-01

现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-26&CARS-25）；北京市农林科学院科技创新能力建设专项新学科培养项目（KJCX20140204）；果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室项目（Z141105004414037）。

曹承旭（1992— ），女，硕士，研究方向为食品科学。

张超（1978— ），男，博士，副研究员，研究方向为农产品加工。