肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在B淋巴瘤细胞株中的敏感性及诱导细胞凋亡机制*

卿晓玲，陈自敏，陈　瑜，王　洪，李　艳，余　赟，余小凤，尹春莉，姚双群，田茂岑，杨　平，李敏惠

1.成都医学院 生物医学系(成都　610083)；2.成都医学院 基础医学院(成都　610083)；3.成都医学院 科研实验中心(成都　610083)



肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在B淋巴瘤细胞株中的敏感性及诱导细胞凋亡机制*

卿晓玲1，陈自敏1，陈瑜1，王洪1，李艳1，余赟2，余小凤1，尹春莉1，姚双群1，田茂岑1，杨平2，李敏惠3△

1.成都医学院 生物医学系(成都610083)；2.成都医学院 基础医学院(成都610083)；3.成都医学院 科研实验中心(成都610083)

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)在B淋巴瘤细胞株中的敏感性及TRAIL通过线粒体信号通路诱导人B淋巴瘤细胞株Ramos凋亡的机制。方法采用CCK-8法检测肿瘤细胞增殖，流式细胞术分析细胞线粒体膜电位、细胞表面受体DR4/DR5表达及细胞凋亡率变化，并用Western Blot测定Ramos细胞经TRAIL作用24 h后相关凋亡蛋白的表达水平。结果供试的4株B淋巴瘤细胞中，Ramos细胞为TRAIL敏感株，Ramos细胞表面受体DR4/DR5表达水平明显高于TRAIL耐药株；TRAIL抑制Ramos细胞增殖通过诱导细胞凋亡介导；细胞调亡伴随线粒体膜电位明显变化；Western Blot免疫印迹结果显示，药物作用后，细胞内相关凋亡信号分子包括Caspase-9，Caspase-3，PARP蛋白等均明显活化。结论4株B淋巴瘤细胞株对TRAIL敏感性不同，并与DR4/DR5表达相关；TRAIL抑制Ramos细胞增殖，诱导细胞凋亡，引起线粒体膜电位明显下降，活化Caspase-9及下游凋亡蛋白；线粒体调亡途径是介导TRAIL诱导Ramos细胞凋亡的途径之一。

TRAIL；B淋巴瘤；细胞凋亡；线粒体途径

肿瘤是严重危害人类生命和健康的疾病之一，临床上采取的治疗方法包括手术、化疗、放疗、生物治疗、中医药治疗等。治疗过程中，患者体内毒副作用的产生，使得其疗效往往不尽如人意。目前，应用的抗肿瘤药物对约70%的患者疗效有限，甚至20%～40%的患者可能接受了错误的药物治疗。因此，对于肿瘤患者来说，最大限度降低肿瘤治疗过程中毒副作用的“个体化医疗”意义重大。个体化医疗己成为恶性肿瘤、高血压、糖尿病等重大疾病临床治疗的发展方向和最有效的手段[1-5]。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，即凋亡素2配体 (apoptosis-2 ligand，Apo-2L)，是肿瘤坏死因子TNF 超家族成员之一[6]。TRAIL 对肿瘤细胞呈高选择性的杀伤效应，可诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常组织细胞不敏感，有望成为新一代的抗肿瘤药物[7]。但TRAIL应用于临床还存在一些问题，例如：1)并非所有肿瘤细胞都对TRAIL敏感，比如非小细胞癌和多发性骨髓瘤等；2)出现天然耐药或获得性耐药等情况。TRAIL敏感株筛选有利于癌症医疗个体化，指导TRAIL的临床个体化治疗，从而提高疗效，减轻不良反应，促进医疗资源的合理利用。B淋巴瘤的病理分类众多，能够广泛用于B淋巴瘤的靶向药物相对较少，本研究筛选TRAIL敏感的B淋巴瘤细胞株，并探讨其凋亡诱导效应，对TRAIL应用于肿瘤个体化治疗具有指导意义。

1　材料与方法

1.1实验材料

人B淋巴瘤细胞株Ramos、Raji、CA46、HTB60为本室保存，RPMI 1640完全培养基常规传代培养。CCK-8购自Dojindo公司；EDTA-free的蛋白酶抑制剂Cocktail、Annexin V-PI及JC-1检测试剂盒为Roche产品；抗人GAPDH、PARP、Casepase-3、Casepase-8、Goat anti Rabbit IgG抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司；碘化丙啶PI购自美国Sigma-Aldrich公司；蛋白质预染Marker购自美国Fermentas公司；通用蛋白裂解抽提试剂购自BioTeke公司；化学发光底物Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate购自美国Millipore公司；DR4/DR5流式抗体购自美国BD公司；TRAIL由成都地奥九泓制药厂提供。

1.2细胞培养与传代

细胞用RPMI 1640完全培养基培养，其中胎牛血清含量为10%；置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养，2～3 d传代，具体情况视细胞的生长速度而定。为保证无微生物污染，常规采用青霉素、链霉素抗细菌污染，并定期用去支原体抗生素处理。取对数生长期的细胞用于药物实验。

1.3细胞增殖测定

人B淋巴瘤细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，每2～3 d传代1次，取对数生长期的肿瘤细胞做增殖抑制实验。细胞以104/孔的数目铺板于96孔板中，加入TRAIL作用24 h后，再加入10 μL/孔的CCK-8，4 h后在A450 nm处测定其吸光值。细胞抑制率(IC)=(1-OD实验组平均值/OD对照组平均值)×100%。

1.4细胞表面TRAIL受体—DR4/DR5表达测定

采用DR4/DR5流式抗体染色人B淋巴瘤细胞30 min，并以未染色的细胞为同性对照，流式细胞仪测定其在细胞表面的表达情况。

1.5细胞凋亡测定

TRAIL作用Ramos细胞12 h，离心得细胞，洗涤后，用双染试剂Annexin V-FITC/PI染色15～20 min， 离心、洗涤，用染色Buffer重悬后，流式细胞仪测定FITC/PI对应的荧光通道，正常细胞为FITC-/PI-，凋亡早期细胞为FITC+/PI-，凋亡晚期及坏死细胞为FITC+/PI+。

1.6线粒体膜电位检测

JC-1染色液是一种用于检测细胞线粒体膜电位改变(△Ψm)的荧光探针。JC-1染料探针是以电势依赖方式积聚在线粒体中，在正常细胞的线粒体中，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物并发红色荧光；在损伤的线粒体中，其细胞膜电位下降或丧失，JC-1以单体形式存在于细胞的胞浆中，发绿色荧光。所以，测定细胞JC-1荧光的变化，可以直接反映△Ψm。

JC-1检测细胞线粒体膜电位时，将TRAIL作用后的Ramos细胞及其对照离心洗涤后，JC-1探针37 ℃，染色20 min，洗涤后PBS重悬，流式细胞仪检测其在细胞内红/绿荧光强度的比例分布，进而判定细胞膜电位的改变状态。

1.7Western Blot检测凋亡相关蛋白

TRAIL作用后，Ramos细胞离心、洗涤，根据铺板细胞数加入相应体积的细胞裂解液，冰上放置30 min，离心得蛋白溶液，BCA 法定量蛋白浓度；SDS-PAGE电泳后，PVDF转膜2 h，5%脱脂奶粉37 ℃，封闭60 min，一抗(1∶2 000稀释)，4 ℃孵育过夜，洗涤后，二抗37 ℃，孵育1.5 h，化学发光液ECL显色，化学发光成像系统成像。GAPDH为内参蛋白，以样品中目的蛋白的光密度值/相应 GAPDH的光密度值，反映目的蛋白的相对水平。

1.8统计学方法

2　结果

2.1Ramos淋巴瘤细胞为TRAIL敏感株

为观察TRAIL对B淋巴瘤细胞的增殖抑制作用，利用CCK-8法检测TRAIL不同药物浓度(0～50 μg/mL)压力下，作用24 h后，对B淋巴瘤细胞的生长抑制率。结果显示，TRAIL对Ramos、HTB60、CA46细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为60 ng/mL、0.4 μg/mL和24 μg/mL；而Raji细胞抑制结果显示，即使是高浓度(50 μg/mL)的TRAIL，对细胞的生长抑制率也只有25%。对TRAIL而言，当100 ng/mL TRAIL作用于肿瘤细胞，其对细胞增殖抑制率达不到50%时，则被定义为该细胞株对TRAIL不敏感。即Ramos淋巴瘤细胞是TRAIL的敏感株，HTB60和CA46为其不敏感株，Raji为其耐药株(图1)。

2.2B淋巴瘤细胞表面受体DR4/DR5的表达与TRAIL敏感性相关

IC50结果显示，TRAIL对B淋巴瘤细胞的抑制能力是Ramos>HTB60>CA46 >Raji。流式检测细胞表面的TRAIL 受体-DR4/DR5的表达，从所测数据(把DR4和DR5的表达求和并平均)来看，Ramos、HTB60、CA46、Raji细胞死亡受体的表达分别为52.8%、43.1%、35.6%、16.1%，可见药物敏感与死亡受体表达量趋势一致。Ramos细胞表面受体DR4/ DR5表达最高，TRAIL对其抑制效果最好。

图2B淋巴瘤细胞表面受体DR4/DR5表达

2.3TRAIL对Ramos淋巴瘤细胞的诱导凋亡效应

为确定TRAIL对Ramos细胞的增殖抑制作用是否由细胞凋亡引起，研究采用Annexin V-FITC/PI 双染的方法，通过流式细胞仪检测经不同浓度TRAIL处理12 h后的Ramos细胞的凋亡诱导效应，结果显示，TRAIL作用浓度分别为100、50、25、0 ng/mL时，诱导细胞凋亡比例依次为42.1%、30.4%、16.5%、4.8%，结果显示，与对照比较，差异有统计学意义(P<0.05)，即TRAIL对Ramos细胞的增殖抑制作用由诱导细胞凋亡介导(图3)。

2.4TRAIL引起Ramos细胞线粒体膜电位下降

TARIL处理Ramos细胞12 h后，细胞经JC-1染色，流式细胞仪检测其线粒体膜电位，结果显示，TARIL作用浓度分别为100、50、25、0 ng/mL时，Ramos细胞△Ψm的比例依次为42.8%、29.6%、22.1%、4.7%。由此可见，TARIL处理Ramos细胞后，可引起细胞线粒体膜电位下降，与对照比较，差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。

图3Annexin V-FITC/PI检测Ramos细胞凋亡

注：A.流式结果图；B.统计学分析结果；与CN比较，*P<0.05

图4JC-1检测Ramos细胞线粒体膜电位

注：A.流式结果图；B.统计学分析结果；与CN比较，*P<0.05

2.5TRAIL对Ramos细胞凋亡蛋白的活化情况

TRAIL诱导Ramos细胞凋亡，并引起线粒体膜电位明显下降。线粒体凋亡途径中，标志性蛋白是否参与了Ramos细胞的凋亡过程，利用Western Blot技术对该信号通路中的凋亡蛋白Caspase-9，Caspase-3及PARP进行了测定。结果显示，TRAIL促进线粒体凋亡途径的标志蛋白Caspase-9活化，Cleaved Caspase-9表达增加；活化下游调亡蛋白Caspase-3和PARP，表达Cleaved Caspase-3及Cleaved PARP，与对照比较，差异有统计学意义(P<0.05)(图5)。

图5Western Blot 检测凋亡蛋白的表达

注：A.Western Blot结果图；B.统计学分析结果；与CN比较，*P<0.05

3　讨论

TRAIL具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞几乎无影响的特性，有望成为新一代的抗肿瘤药物[8]，但并非所有肿瘤细胞都对TRAIL敏感。有报道[7]显示，部分癌细胞对TRAIL引发的凋亡作用的敏感性较低甚至有完全耐受的现象，特别是在肿瘤化疗过程中逐渐累积产生的获得性耐受。因此，筛选TRAIL药物敏感株是推进其临床应用亟待解决的关键问题。

TRAIL通过与表达在细胞表面的特异性受体结合从而发挥生物学功能，而目前发现的TRAIL受体一共有以下5种：TRAIL-R1/DR4、TRAIL-R2/DR5、TRAIL-R3/DcR1、TRAIL-R4/DcR2和OPG。根据其功能与结构的不同，可分为3类：1)死亡受体：DR4和DR5；2)诱骗受体：DcR1和DcR2；3)可溶性受体：OPG。其中，主要发挥凋亡介导作用的是死亡受体DR4和DR5。本研究结果显示，Ramos细胞为TRAIL敏感株；供试的4株B淋巴瘤细胞其受体DR4/DR5表达量与TRAIL敏感性相关联，更多的细胞株测试将有助于确定该结论。TRAIL耐药株可以通过化疗药等药物逆转其对TRAIL的耐受，比如上调DR4或DR5表达来逆转肿瘤细胞对TRAIL的耐受[9-10]。

TRAIL与DR4/DR5特异性结合后，诱导DR4/DR5形成同源或异源二聚体，该二聚体招募FADD，FADD通过它的死亡效应结构域与Caspase-8的相应区域结合，激活Caspase-8及其下游效应蛋白Caspase-3，启动细胞调亡[8]。另外，证实TRAIL诱导Ramos细胞凋亡，引起线粒体膜电位明显下降，促进线粒体凋亡途径的标志蛋白Caspase-9活化，最终活化下游调亡蛋白Caspase-3和PARP，说明线粒体调亡途径是TRAIL引起Ramos细胞凋亡的途径之一。

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Study on the Sensitivity of TRAIL in B Lymphoma Cell Lines and TRAIL-induced Apoptosis

QingXiaoling1，ChenZhimin1，ChenYu1，WangHong1，LiYan1，YuYun2，YuXiaofeng1，YinChunli1，YaoShuangqun1，TianMaocheng1，YangPing2，LiMinhui3△.

1.SchoolofBiomedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China; 2.SchoolofBasicMedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China；3.CenterofScientificResearch,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China

ObjectiveTo investigate the sensitivity of TRAIL in B lymphoma cell lines and the mechanism of Ramos apoptosis induced by TRAIL via the mitochondrial signaling pathways. MethodsThe CCK-8 assay was adopted to detect the tumor cell proliferation. The flow cytometry was used to analyze the cell mitochondrial membrane potential, the cell surface receptors DR4/DR5 expressions and the changes of apoptosis. The Western Blot Test was employed to test the expression levels of apoptosis protein after 24 hours with TRAIL stimulation. Results Among the 4 B lymphoma cell lines, Romas cells are the sensitive cell strain to TRAIL and the DR4/DR5 expression levels were significantly higher than the drug-resistant strains of TRAIL. TRAIL inhibited Ramos cell proliferation by inducing the cell apoptosis accompanied by the significant changes of mitochondrial membrane potential. The results of Western-Blot Analysis indicated that the apoptotic signal molecules such as Caspase-9, Caspase-3 and PARP were significantly activated. ConclusionThe sensitivity of the 4 experimental B lymphoma cell lines to TRAIL is different and it is related to the DR4/DR5 expressions. TRAIL inhibits cell proliferation of Ramos Cells, induces their apoptosis, decreases the mitochondrial membrane potential significantly, and activates Caspase-9 and Caspase-3. Mitochondrial apoptosis pathway is one of the ways to mediate the apoptosis of Ramos cells induced by TRAIL.

TRAIL; B lymphoma; Apoptosis; Mitochondrial signaling pathways

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.04.005

四川省教育厅项目(No:13ZB0220)；四川省科技厅项目(No:2015JY0205)；四川省卫生厅项目(No:130302,130298)；国家级大学生创新项目(No:201313705007,201313705003,201413705005)；成都医学院科研基金(No:CYZ11-005)

李敏惠，E-mail：252710700@qq.com

R730.5

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网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160613.1056.020.html