甾类化合物降解菌D61的分离鉴定及其降解特性

林龙云, 于曙光, 柯兰兰, 潘大仁

(1.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002；2.青岛农业大学化学与药学院，山东 青岛 266109)



甾类化合物降解菌D61的分离鉴定及其降解特性

林龙云1, 于曙光2, 柯兰兰1, 潘大仁1

(1.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002；2.青岛农业大学化学与药学院，山东 青岛 266109)

从杂草土壤中分离得到利用甾类化合物作为唯一碳源的菌株D61.经16S rDNA多态性分析鉴定菌株D61为肠杆菌科哈夫尼菌属，在20～37 ℃、pH 2.0～9.0的环境中生长较好，无卡那霉素抗性.降解试验和荧光定量PCR试验结果表明，菌株D61可通过paaC基因的环氧化作用途径对甾类化合物进行降解转化，其对睾丸酮的降解能力与阳性对照菌睾丸酮丛毛单胞菌相似，对雌酮的降解能力明显优于睾丸酮丛毛单胞菌.

甾类化合物; 降解; 菌株D61

随着社会的不断发展，特别是现代医药及化学工业的发展，包括睾丸酮、雌二醇和雌酮在内的大量甾类化合物不断地通过生产或生活等释放并污染土壤和水，给地球上的生物包括人类的生长、发育和繁殖都构成潜在的威胁和风险[1].甾类化合物污染的研究始于上世纪90年代.我国2000年开始对环境甾类化合物污染、毒理学等方面进行大量研究，发现我国重要河流、淡水湖泊，以及近海海域和污水灌溉土壤中，均存在不同程度的类固醇污染[2-4].因此，国内外学者积极地从环境中筛选分离甾类化合物降解菌[5-9].陶玉贵等[10]从农药厂排污沟污泥中分离得到1株哈夫尼菌属菌株，能以毒死蜱为唯一碳源降解毒死蜱.除此之外，鲜有以哈夫尼菌作为降解菌的研究报道，更无哈夫尼菌降解甾类化合物的相关研究报道.戴艺民、陈建秋等[11-12]对降解甾类化合物细菌——睾丸酮丛毛单胞菌进行研究.本研究尝试从周边环境分离新甾类化合物降解菌，并对其降解特性进行研究，为进一步利用新分离菌株进行环境修复及降解机理的研究提供依据.

1　材料与方法

1.1材料和仪器

1.1.1材料以福建农林大学生物楼前杂草土壤作为分离甾类化合物降解菌的材料.以本实验室保存的睾丸酮丛毛单胞菌(ComamonastestosteroniATCC11996, Ampr)作为阳性对照菌株.无机盐培养基(SIN)：1.0 g·L-1(NH4)H2PO4+1.0 g·L-1(NH4)2HPO4+2.0 g·L-1KH2PO4+0.2 g·L-1MgSO4·7H2O ，pH 7.0.LB培养基：10 g·L-1蛋白胨+5 g·L-1酵母膏+10 g·L-1NaCl，pH 7.0.固体培养基添加14 g·L-1琼脂，相关培养基经120 ℃高压蒸汽灭菌25 min，备用.睾丸酮、雌二醇和雌酮由大连美仑生物公司提供.

1.1.2主要仪器设备96孔PCR仪(型号AG22331)，为德国艾本德股份公司产品；高效液相色谱仪(型号1260)，为安捷伦科技有限公司产品；冷冻离心机(型号5810R)，为德国艾本德股份公司产品；PikoReal荧光定量PCR仪(型号5100)，为赛默飞世尔科技(芬兰)有限公司产品.

1.2方法

1.2.1甾类化合物降解菌株的分离称取5 g土壤加到含有0.2 mmol·L-1睾丸酮的SIN液体培养基中，在37 ℃、180 r·min-1摇床中培养.每3 d按1%的接种量,取前一次培养的菌液依次在含有0.4、0.6和1.0 mmol·L-1睾丸酮的SIN液体培养基中富集培养.参考Sang et al[6]和于源华等[7]从海水中分离降解甾类化合物细菌的方法，将富集培养的菌液用无睾丸酮的SIN液体培养基按1∶106稀释，取200 μL分别均匀涂于5个含有1.0 mmol·L-1睾丸酮的SIN固体培养基上，37 ℃过夜培养.从每个过夜培养的培养皿中挑取10个以上的单菌落(依次编号)，用30 μL无睾丸酮的SIN液体培养基稀释后，取5 μL分别置于无睾丸酮的1/10 SIN固体培养基A和含1.0 mmol·L-1睾丸酮的1/10 SIN固体培养基B中，挑选可有效利用睾丸酮作为碳源的菌株进行纯化及进一步研究.

1.2.2新分离菌株的DNA提取及16S rDNA鉴定采用上海生工的细菌基因组DNA快速提取试剂盒进行DNA提取.采用细菌16S rDNA PCR扩增通用引物[13](溶解浓度均为10 μmol·L-1)对新分离菌株进行种属鉴定.上游引物27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3.下游引物1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3.PCR反体系为5 μL Buffer+1 μL dNTP+0.5 μL rTag+2 μL 27F引物+2 μL 1492R引物+38.5 μL dH2O，总体积为50 μL.PCR扩增反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，61 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min,30个循环，72 ℃延伸10 min.扩增产物送至铂尚生物公司进行测序.将测序结果交至NCBI在线比对后，选择相似度较高和具有代表性的相似菌种16S rDNA序列，用MEGA(版本号为6.06)进行多序列比对及系统进化树绘制.

1.2.3新分离菌株的生长条件及抗性研究新分离菌株在LB培养基中经37 ℃、180 r·min-1过夜培养后，用LB培养基将菌液调至D595 nm=1.0.取250 μL菌液加入5 mL LB培养基，在180 r·min-1摇床中分别按相应条件进行过夜培养.温度分别为15、20、27和37 ℃.pH值分别为2.0、5.0、7.0、9.0和11.0.抗生素条件分别为100 μg·mL-1氨苄青霉素(Amp)、30 μg·mL-1卡那霉素(Kan)、50 μg·mL-1链霉素(St)、50 μg·mL-1利福平(Rif)和300 μg·mL-1羧苄青霉素(Carb).

1.2.4新分离菌株对不同甾类化合物的降解新分离菌株在37 ℃、180 r·min-1摇床中过夜培养后，以LB培养基稀释至D595 nm=1.0.取250 μL菌液加入分别含有0.2 mmol·L-1睾丸酮、0.02 mmol·L-1雌二醇、0.02 mmol·L-1雌酮的5 mL SIN和LB液体培养基中，各种处理均为3次重复，在37 ℃、180 r·min-1摇床中培养19 h后，通过高效液相进行各处理中甾类化合物的降解剩余量的检测.菌株睾丸酮丛毛单胞菌(C. T.)按重复数和条件进行处理，作为降解试验的阳性对照.

1.2.5高效液相检测培养液中甾类化合物含量的测定将经降解处理的培养液置于85 ℃烘箱，烘干水分后，加入1 mL色谱甲醇充分溶解，经尼龙滤膜(0.45 μm)过滤后，高效液相检测甾类化合物含量.高效液相色谱条件为：流动相甲醇∶水=80∶20；流速为0.8 mL·min-1；上样量为50 μL；柱温为30 ℃.检测睾丸酮波长为254 nm，出峰时间为6 min.检测雌二醇和雌酮的波长均为205 nm，分别在5.2和5.5 min出峰.

1.2.6苯乙酸降解蛋白目的基因(paaC)的克隆及其降解甾类化合物的差异表达分析根据UniProtKB中报道的A0A038CSW7的苯乙酸降解蛋白，经NCBI/BLAST/tblaxtn检索，获得相应基因paaC序列后，使用Primer Premier 5.0软件设计上下游引物.以D61菌株的DNA为模板，上游引物paaC XH F：5′-TGCTCTAGATTACCACTGCTGACCGGGATA-3′.下游引物paaC XH R：5′-CCCAAGCTTATGAACAACC TGAATCCCGT-3′.获得paaC基因片段，将该片段与载体pMD 18-T连接并转化到Trans5αChemically Competent Cell中，送至铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序.根据测序结果输入NCBI进行对比，并使用Primer Premier 5.0软件进行荧光定量PCR引物设计.以D61菌株的16S rDNA基因作为荧光定量PCR内参基因，内参基因上游引物QD6 16s-F：5′-GGAGCAAACAGGATTAGATACCC-3′.内参基因下游引物QD6 16s-R：5′-CGGAAGCCACGCCTCAA-3′.

新分离菌株以LB培养基进行培养，对照添加甲醇进行培养.过夜培养后，分离菌体以全式金TransZolTM Up提取RNA，TaKaRa Prime ScriptTM 1ST Strand cDNA Synthesis Kit进行cDNA第1链的合成后，以Perfect Real time染料法实时荧光定量试剂盒在PikoReal荧光定量PCR仪上对试验样品进行荧光定量PCR分析.分析结果经PikoRealTM Software 2.1软件分析，获得在阈值600条件下的PCR反应循环数：Ct(处理目的基因)、Ct(处理内参基因)、Ct(对照目的基因)和Ct(对照内参基因).应用相对定量方法计算特征基因表达的差异量2-△△Ct，其中：△△Ct=△Ct(处理)-△Ct(对照)；△Ct(处理)=Ct(处理目的基因)-Ct(处理内参基因)；△Ct(对照)=Ct(对照目的基因)-Ct(对照内参基因).

2　结果与分析

2.1甾类化合物降解菌的分离和纯化

富集培养后，经涂板挑菌分离筛选的63株细菌，在无睾丸酮的1/10 SIN固体培养基A上无法生长或生长明显缓慢，而有6个菌株在含1.0 mmol·L-1睾丸酮的1/10 SIN固体培养基B中能够以睾丸酮为唯一碳源，较好地生长(图1).本试验对上述6个菌株进行初步甾类化合物降解对比试验，选取编号61的菌株(图1箭头所指示)，将其命名为D61，并进行划线纯化和进一步的生长条件研究和降解能力鉴定.

2.2新分离菌株D61的16S rDNA鉴定

D61经16S rDNA PCR扩增和测序，获得的序列长度为1 391 bp，在GenBank中比对后，选择相似度较高的菌种及C. T.等有代表性的菌种16S rDNA序列，经MEGA(版本号为6.06)进行多序列比对，并绘得系统进化树(图2).从图2可知，其与数据库中的肠杆菌科哈夫尼菌属的大多数菌种的16S rDNA序列的相似度达到了98%以上，鉴定菌株D61属于肠杆菌科哈夫尼菌属.

2.3菌株D61的生长条件及抗性

通过测定15～37 ℃菌株D61的生长量可知：菌株D61在15 ℃下，生长量明显减少，而在20～37 ℃，可以正常生长，生长量接近15 ℃时的3倍(图3).通过不同pH值条件试验可知，D61在pH值2.0～9.0范围内均能较好生长，但在pH达到11时，其无法生长(图4).D61在添加一定量的氨苄青霉素、链霉素、利福平和羧苄青霉素的LB培养基内均能较好地生长，而在添加卡那霉素的LB培养基中几乎无法生长(图5).由此可确定菌株D61后续试验的培养条件为：pH值7.0，氨苄青霉素100 μg·m L-1，温度37 ℃.

2.4菌株D61对不同甾类化合物的降解效果

菌株D61和C. T.在pH值7.0、100 μg·mL-1氨苄青霉素、培养温度37 ℃条件下培养19 h后，通过高效液相测定培养基内剩余甾类化合物的含量，进而计算获得相应菌株甾类化合物的降解率(图6).在营养物质匮乏的SIN液体培养基中，菌株D61和C. T.对睾丸酮的降解率分别为30.9%和30.5%，对雌二醇降解率分别为15.2%和16.4%，对雌酮降解率分别为60.6%和37.2%.在富营养的LB液体培养基中，菌株D61和C. T.对睾丸酮的降解率分别为70.5%和70.3%，对雌二醇降解率分别为21.1%和32.7%，对雌酮降解率分别为44.0%和35.1%.

2.5paaC基因克隆及荧光定量PCR验证

D61菌株与C. T.菌株同样具有降解甾类化合物的能力，但PCR和ELISA试验结果表明，D61菌株中不含有3α-HSD基因.而以paaC基因特异引物对D61菌株的DNA进行PCR扩增，获得756 bp的特征片段，经测序比对分析，结果表明其与paaC基因的同源性达到99%(图7).根据测序结果，设计荧光定量PCR引物.paaC QF：5′-CTGTTCCACCAGCAGGAGATTG-3′.下游引物paaC QR：5′-CTGAGTTGGCGGGGAGCGGCGA-3′.荧光定量PCR结果显示，在含有睾丸酮、雌二醇和雌酮的LB培养基中，paaC基因的表达量分别提高1.9、1.3和3.0倍，证明D61在降解以上3个甾类化合物时paaC基因具有一定活性.

3　讨论

本研究成功筛选分离出能够利用睾丸酮作为碳源快速生长的菌株D61.通过16S rDNA序列的测定分析，初步鉴定菌株D61为肠杆菌科哈夫尼菌属.

本研究分离的哈夫尼菌属D61菌株，在富营养的LB培养基和营养物质匮乏的SIN培养基中，对睾丸酮、雌二醇和雌酮均有一定的降解能力；且在相同试验条件下，降解雌酮的效率明显大于C. T.菌株，降解睾丸酮的效率基本与C. T.菌株相同.Teufel et al[14]研究指出，paaC等基因的环氧化作用使芳香族化合物的芳香族环上1个双键两端碳原子被加上一原子氧形成三元环，破坏芳香族环的稳定性；并在其他酶作用下芳香族环开环，最终被逐步降解.对D61菌株的paaC基因克隆及荧光定量PCR验证结果表明，加入睾丸酮和雌酮后paaC基因表达量显著增加.因此，环氧化反应的代谢途径可能是D61菌株降解甾类化合物的重要途径.通过对D61菌株的生长温度、pH值和抗性等特点的研究，结果表明D61菌株可以应用于20～37 ℃、pH值酸性或弱碱性的环境中进行环境甾类化合物污染修复.同时，因D61菌株不适于在强碱性条件下生长和不抗卡那霉素的特点，故在环境修复后期，可以通过pH值调节或加入一定量的卡那霉素抑制该菌株生长，以免对环境造成二次污染.因此，可以利用菌株D61进行后续环境甾类化合物污染的修复.

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(责任编辑:叶济蓉)

Isolation and degradation characteristics of steroid-degrading bacterial strain D61

LIN Longyun1, YU Shuguang2, KE Lanlan1, PAN Daren1

(1.College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.College of Chemistry and Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109, China)

Bacteria that effectively degrades anthropogenic steriod merges to be an environmental friendly tool in pollution abatement. In this study, bacterial strain D61 was isolated from weed soil and fed on 0.2 mmol·L-1exogenous steroid as the only carbon source, and followed by 16S rDNA polymorphism analysis to identify its species. The optimum growing condition was detected by growing the strain in ambient temperature between 15 ℃ and 37 ℃ under pH from 2 to 11. Futhermore, resistance of strain D61 to antibiotics and its degradation efficacy on steriod, inclduing testosterone, estradiol and oestrone, were evaluated. Results showed that strain D61 belonged to genusHafniaof familyEnterobacteriaceae. Strain D61 favored growing condition of 20-37 ℃ and pH 2.0-9.0. Strain D61 showed no resistance to Kanamycin. Degradation experiment and quantitative PCR analysis showed that strain D61 degraded steroids via epoxidation ofpaaCgene. Degradation rate on testosterone was similar to that of strainComamonastestosteronewhich was used as positive control, but was significantly higher than that of estrone.

steroid; degradation; strain D61

2016-01-10

2016-02-20

国家自然科学基金资助项目(31270676).

林龙云(1981-)，男，讲师.研究方向：生物化学与分子生物学.Email:9884318@qq.com.通讯作者潘大仁(1949-)，男，教授，博士生导师.研究方向：生物技术.Email:pdr8598@163.com.

Q89

A Q89

1671-5470(2016)03-0320-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.03.014