巨型艾美耳球虫IMP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

林　倩, 黄驹辉, 唐牧之, 江和基, 黄志坚, 殷光文

(福建农林大学动物科学学院/福建省动物药物工程实验室,福建 福州 350002)



巨型艾美耳球虫IMP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

林倩, 黄驹辉, 唐牧之, 江和基, 黄志坚, 殷光文

(福建农林大学动物科学学院/福建省动物药物工程实验室,福建 福州 350002)

免疫映射蛋白1(IMP1)是一种从巨型艾美耳球虫中发现的蛋白，具有良好的免疫原性和免疫保护性.本试验通过EmIMP1基因的克隆、原核表达以及多克隆抗体的制备，为后续深入研究该蛋白的生物学及免疫学功能奠定基础.首先，从未孢子化的巨型艾美耳球虫新疆株卵囊中提取总RNA，反转录合成cDNA，PCR扩增EmIMP1基因片段.其次，将EmIMP1基因扩增片段连接到原核表达载体pET-28a构建表达质粒pET-28a-EmIMP1，转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株并进行表达；将纯化后的蛋白与等量弗氏佐剂乳化后皮下注射至2只新西兰大白兔体内，每隔2周免疫一次，一共免疫4次后取得的兔血清即为多克隆抗体.最后，用所获得的多克隆抗体，对纯化后的EmIMP1进行免疫印迹试验鉴定，用酶联免疫吸附测定法检测多克隆抗体的效价.结果表明，克隆出的EmIMP1基因的全长为1 140 bp，诱导出的蛋白大小为70 ku ，且该蛋白在上清液和包涵体中均有存在.免疫印迹试验检测结果显示，用上述方法制备的多克隆抗体具有良好的特异性，酶联免疫吸附测定法检测结果表明该多克隆抗体具有高效价. 因此，可通过原核表达蛋白EmIMP1免疫兔子制备特异性好且效价高的多克隆抗体.

巨型艾美耳球虫;IMP1基因; 原核表达; 多克隆抗体

鸡球虫病是危害养禽业的重要寄生虫病，每年给全球养禽业带来超过20亿英镑的经济损失[1-3].巨型艾美耳球虫(Eimeriamaxima)的致病力比较强，对鸡的危害大.巨型艾美耳球虫在我国广泛存在[4]，在福建省的福州、福清、泉州、晋江和漳州的鸡场已检出巨型艾美耳球虫[5-6].药物防治是控制球虫病的重要手段，但随着药物耐药性的产生[7-8]，以及人们对动物性食品安全问题意识的提高，疫苗免疫被认为是一种有效的防治鸡球虫病的方法[9-10].基因工程疫苗作为一种新型疫苗具有广阔前景，但需要合适的保护性抗原.免疫映射蛋白1(immune mapped protein-1, IMP1)是一种从巨型艾美耳球虫中发现的蛋白，鸡免疫原核表达的蛋白IMP1或者DNA疫苗，可以对同源球虫的攻虫产生较好的保护，与对照组相比，卵囊排出量可以减少50%左右，具有良好的免疫原性和免疫保护性[11]，是很有前景的疫苗候选抗原.IMP1基因片段在弓形虫、鸡其他种类球虫和犬新孢子虫中均存在同源序列[12].然而，关于IMP1在虫体中的表达、分布以及生物学功能，却知之甚少.为解决这一问题，本试验以巨型艾美耳球虫cDNA为模板，克隆出EmIMP1基因，利用原核表达系统表达EmIMP1并制备多克隆抗体，为未来EmIMP1的相关研究提供参考.

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物2只体重约2 kg的无球虫新西兰大白兔购于吴氏动物公司，饲养于实验室中，定时喂水喂料.试验前及饲养过程中，对2只兔进行球虫检查，以确保兔子全程未感染球虫.

1.1.2球虫卵囊巨型艾美耳球虫卵囊(新疆株)，由中国农业大学索勋教授赠送，复壮后保存在4 ℃的冰箱中.

1.1.3引物根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中的EmIMP1基因序列(FN813227)设计引物，并引入酶切位点EcoⅠ和XhoⅠ，引物序列如下.上游引物(EmIMP1-EcoⅠ-5′)：GAATTCATGGGGGCCGCTTGCGGGAAATCGCAGC，下游引物(EmIMP1-XhoⅠ-3′)：CTCGAGATCTTGCGACACTTTAGTGGGCTCTG(划线部分为引入酶切位点)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

1.1.4试剂卡那霉素购于Slarbio公司；Trizol、cDNA反转录试剂盒、pEASY-Blunt Simple克隆试剂盒、质粒小量提取试剂盒、质粒大量提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、ProteinIsoNi-NTA Resin、HRP标记的羊抗兔IgG、PVDF膜和TMB显色液购于北京全式金生物技术有限公司；IPTG、EcoRⅠ、XhoⅠ、PrimeSTAR HS DNA Polymerase和DNA连接试剂盒购于TaKaRa公司；弗氏佐剂和弗氏不完全佐剂购于Sigma公司；Trans1-T1抗噬菌体化学感受态细胞和BL21(DE3)化学感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司；pET-28a载体购于Novagen公司.

1.2方法

1.2.1EmIMP1基因片段的扩增将巨型艾美耳球虫新疆株卵囊接种至10只2周龄无球虫AA肉鸡体内，收集6～9 d的鸡粪，采用饱和盐水漂浮法收集球虫卵囊.在未孢子化的卵囊中加入Trizol和直径为0.5 mm的玻璃微珠室温涡旋振荡5 min破碎卵囊壁，按说明书所示步骤操作以获得全RNA.用随机引物合成cDNA.采用PrimeSTAR HS DNA Polymerase从获得的cDNA中克隆出EmIMP1基因片段.PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，用DNA胶回收试剂盒将目的片段EmIMP1基因回收.取4 μLEmIMP1基因片段和1 μL pEASY-Blunt Simple载体于37 ℃反应15 min以构建克隆质粒pEASY-Blunt Simple-EmIMP1，转化至Trans1-T1抗噬菌体化学感受态细胞.PCR鉴定为阳性菌落的用LB液体培养基扩培后，用质粒小量提取试剂盒提取质粒pEASY-Blunt Simple-EmIMP1，保存于-20 ℃的冰箱中.

1.2.2重组质粒pET-28a-EmIMP1的构建将空载体pET-28a和pEASY-Blunt Simple-EmIMP1分别用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切5 h，回收pET-28a和片段EmIMP1基因.用DNA连接试剂盒连接经过酶切的pET-28a和EmIMP1基因.取3 μL经过酶切的pET-28a载体和7 μL片段EmIMP1基因加入到10 μL连接酶SolutionⅠ中，于16 ℃连接2 h后将20 μL连接产物转化至100 μL Trans1-T1抗噬菌体化学感受态细胞中.菌液经PCR鉴定后扩培，用质粒大量提取试剂盒提取质粒pET-28a-EmIMP1，双酶切鉴定质粒并送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序.

1.2.3重组蛋白EmIMP1的表达取2 μL经过测序的重组质粒pET-28a-EmIMP1转化至BL21(DE3)化学感受态细胞中，挑取菌落扩培.于37 ℃、200 r·min-1培养至D600 nm为0.6～0.8，取3 mL菌液收集菌体作为空白对照后加入IPTG至终浓度为1 mmol·L-1，诱导2 h，取3 mL菌液离心收集菌体.加入Bing Buffer超声破碎，分离上清液和沉淀，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白是否为可溶性表达[13].

1.2.4重组蛋白EmIMP1的纯化上清液经0.22 μm滤膜过滤除杂后，采用ProteinIsoNi-NTA Resin填料的柱子纯化蛋白.包涵体处理方法如下：将沉淀在包涵体裂解液中搅拌均匀后放入用透析袋处理液处理过的透析袋中，完全浸没于4.5 mol·L-1尿素溶液中12 h.之后每隔12 h更换尿素溶液，尿素的浓度按3.5、2.5、1.5、1.0和0.5 mol·L-1的梯度更换，最后用1×PBS浸泡24 h.将透析袋中的液体装进离心管离心，取上清液，采用ProteinIsoNi-NTA Resin填料的柱子纯化.

1.2.5多克隆抗体的制备免疫前采血作为阴性对照，将1 mL 500 μg·mL-1重组蛋白与等量的完全弗氏佐剂乳化后经背部皮下注射给兔.2周后注射等量的不完全弗氏佐剂与蛋白的混合液，之后每隔2周免疫一次.免疫时采血，共免疫4次后，于心脏采血分离的血清即为多克隆抗体，保存于-20 ℃的冰箱中.

1.2.6抗体特异性的检测将纯化后的EmIMP1采用12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，用半干转法将凝胶转移至PVDF膜上.用制备的多克隆抗体作为一抗(1∶105)于37 ℃孵育40 min；HRP标记羊抗兔IgG作为二抗(1∶104)，于37 ℃孵育40 min，进行免疫印迹试验检测.

1.2.7效价的检测采用96孔板包被100 μL含量为2 μg·mL-1经过纯化的EmIMP1.包被液作为空白对照，免疫前的兔血清作为阴性对照，制备的多克隆抗体为一抗，按1∶400、 1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600和1∶51 200的梯度稀释，每个样品重复3次.二抗HRP标记羊抗兔IgG按1∶5 000的比例稀释.用TMB显色，0.5 mol·L-1H2SO4终止反应，于450 nm波长的酶标仪下读数.对每次免疫后产生的抗体进行检测.根据效价检测结果，将每次采血获得的血清按1∶51 200的比例稀释后作为一抗，其余条件同上.

2　结果与分析

2.1EmIMP1基因扩增结果

用EmIMP1基因引物PCR扩增cDNA，产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，可见一条大于1 000 bp的DNA特异性条带(图1)，与EmIMP1基因的预期值(1 140 bp)相符.

2.2重组质粒pET-28a-EmIMP1的鉴定

采用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒pET-28a-EmIMP1，双酶切下的DNA片段与实际大小(1 140 bp)相符(图2).

含有重组质粒pET-28a-EmIMP1的菌液用EmIMP1基因引物鉴定，结果出现一条大小约为1 100 bp的条带(图3)，与理论长度1 140 bp相符.

2.3重组质粒pET-28a-EmIMP1的表达与纯化

将未加IPTG诱导的菌体和IPTG诱导2 h的菌体采用12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果(图4)显示：诱导2 h的菌体出现清晰的目的条带，大小约为70 ku；而未经诱导的菌体的条带不明显，表明重组蛋白EmIMP1在BL21(DE3)化学感受态细胞中2 h得到表达.

分离出的上清液和包涵体经过12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果(图5)显示，EmIMP1在上清液和包涵体沉淀中均有存在，其主要存在于包涵体中.

将经过Ni2+层析柱纯化后的EmIMP1采用12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果(图6)显示，EmIMP1的大小约为70 ku，且纯化效果较好.

2.4抗体特异性免疫印迹试验检测结果

从抗体特异性免疫印迹试验检测结果(图7)可以看出，在70 ku处获得特异性条带，且其大小与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果相符，表明表达制备的多克隆抗体具有较强的特异性.

2.5酶联免疫吸附测定法检测结果

采用酶联免疫吸附测定法测定所采集的4次血清的抗体效价，结果(图8)显示，产生的EmIMP1多克隆抗体明显高于阴性对照组，抗体稀释至1∶51 200时，D450 nm依旧大于1.

从每次免疫后血清产生EmIMP1特异性抗体(图9)可以看出，前3次免疫后抗体水平都有所提高，第4次免疫后抗体水平略微下降.可见，在今后制备多克隆抗体EmIMP1的试验中，血清最好在第3次免疫后采集.

3　讨论

鸡球虫病对养禽业的危害非常严重，目前市面上使用强毒疫苗和弱毒疫苗来防治鸡球虫[14].强毒疫苗有较强毒性，可能导致强毒球虫引入鸡场，造成损失；弱毒疫苗安全性好，但存在“返强”、繁殖力低及价格昂贵等问题[15].基因工程疫苗的安全性比传统活疫苗高，市场前景广阔.本试验制备的EmIMP1多克隆抗体具有较高的效价和特异性，对未来开发基于EmIMP1的基因工程疫苗以及研究该蛋白在鸡球虫上的生物学功能提供了工具.

PCR克隆出的EmIMP1基因序列长度为1 140 bp，与NCBI报道的大小一致;序列比对结果显示,巨型艾美耳球虫新疆株EmIMP1基因与英国霍顿株序列完全一致，显示该蛋白是一个非常保守的抗原，可以用于球虫亚单位疫苗的研究.理论推测EmIMP1的大小应为42 ku左右，但SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示该蛋白的大小为70 ku左右.一项关于EmIMP1的最新研究得出，EmIMP1在水溶液中是一种不稳定的蛋白[16]，这导致该蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图中显示的特异性条带位置与理论预测不相符[17].关于EmIMP1不稳定的原因，或因组氨酸标签造成SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测的蛋白质分子量偏大[18]；或因发生糖基化所致[19]，至今尚未有明确结论.EmIMP1在上清液和包涵体中均有存在，其主要存在于包涵体中.目前解释这一现象的原因有两种：一是培养温度和pH[20]；二是由蛋白质结构性质决定[21].重组蛋白EmIMP1在水溶液中的不稳定性也可能是导致其在上清液和包涵体中存在的原因.本试验存在少许本底表达，这是因为使用了pET-28a载体所致，可以通过培养基使用更低级的碳源或是加入1%葡萄糖即可抑制乳糖操纵子与乳糖结合产生本底表达[22-23].

研究表明，兔抗RelA抗体的效价为1∶6 400以上[24],兔抗类糜蛋白酶多克隆抗体的效价可达到1∶12 800[25]，与二者相比，本试验采用酶联免疫吸附测定法测定的EmIMP1多克隆抗体的效价高达1∶51 200，且免疫印迹试验检测结果显示该多克隆抗体具有较强的特异性，可用于未来的相关研究.

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(责任编辑:施晓棠)

Prokaryotic expression and preparation of polyclonal antibody against IMP1 protein ofEimeriamaxima

LIN Qian, HUANG Juhui, TANG Muzhi, JIANG Heji, HUANG Zhijian, YIN Guangwen

(College of Animal Science/Engineering Laboratory of Animal Pharmaceuticals, Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou, Fujian 350002, China)

Immune mapped protein-1 (IMP1), found inEimeriamaxima, demonstrates excellent immunogenic and immunoprotecive property. To make full use of this property in coccidiosis prevention, manufacture of polyclonal antibody against EmIMP1 was started with obtainingEmIMP1 gene by RNA extraction from unsporulated oocysts ofE.maximaXinJiang Strain and cDNA synthesis by reverse transcription. Then amplified fragment ofEmIMP1 gene was inserted into prokaryotic expression vector to construct expression plasmid pET-28a-EmIMP1, after that the recombinant vector was transformed into BL21(DE3)E.colifor protein expression. Serum was obtained by subcutaneously injecting the purified protein with the same amount of adjuvant in 2 rabbits every 2 weeks for 4 times. Finally, Western-blot was applied to determine the specificity of the protein and enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) was used to test the titer of the polyclonal antibody. Results showed thatEmIMP1 gene was 140 bp in length and the pressed protein was 70 ku. The protein existed in both supernatant and inclusion body. The polyclonal antibody demonstrated good specificity and high titer. To summarize, IMP1 produced in rabbit was promising to play a protective role in coccidiosis prevention.

Eimeriamaxima;IMP1 gene; prokaryotic expression; polyclonal antibody

2015-08-28

2015-12-15

国家自然科学基金——青年基金项目(31502058)；福建省科技厅引导性项目(2015N0017)；大学生创新创业训练计划项目(201510389187).

林倩(1990-)，女，硕士研究生.研究方向：动物疾病与保健.Email:lq19900720@163.com.通讯作者殷光文(1983-)，男，讲师，博士.研究方向：兽医寄生虫与分子生物学.Email:yinguangwen000@sina.com.

S855.9

A

1671-5470(2016)03-0290-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.03.009