地榆升白片质量标准提升研究△

胡佳，李莎，广兵，王泽宇，邱玲，宋川霞*，邓赟*

(1.成都中医药大学 药学院，中药材标准化教育部重点实验室 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137；2.成都地奥制药集团有限公司，四川 成都 610041)

地榆升白片质量标准提升研究△

胡佳1，李莎1，广兵2，王泽宇1，邱玲1，宋川霞*1，邓赟1*

(1.成都中医药大学 药学院，中药材标准化教育部重点实验室 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137；2.成都地奥制药集团有限公司，四川 成都 610041)

目的：建立和提升地榆升白片制剂鉴别和含量的测定质量标准。方法：采用TLC法对地榆升白片制剂中没食子酸和地榆皂苷Ⅰ进行定性鉴别；采用HPLC波长切换法对制剂中的没食子酸和地榆皂苷Ⅰ同时进行含量测定。结果：TLC鉴别方法斑点清晰、专属性强，简单可行；HPLC法测定中没食子酸和地榆皂苷Ⅰ分别在20.50～184.50、20.70～207.00 μg·mL-1与色谱峰峰面积呈良好线性响应，平均回收率分别为100.03%、100.14%(n=6)，RSD分别为0.58%、1.18%。结论：该方法所建立的质量标准研究方法简便、稳定，可用于地榆升白片的质量控制。

地榆升白片；薄层色谱法；高效液相色谱法；质量标准；没食子酸；地榆皂苷Ⅰ

地榆升白片制剂标准收载于《国家中成药标准汇编》[1]口腔肿瘤儿科分册，是由地榆单味药加工制成的片剂，具有升高白细胞数量的作用。临床上常作为化疗期间的辅助用药，治疗化疗引起的白细胞减少症[2-4]，也可用于治疗精神病药所致的白细胞减少症[5]、干扰素治疗乙型肝炎所致的白细胞减少症[6-7]。在中成药标准汇编鉴别项下仅对没食子酸进行了定性分析，含量测定项下仅测定了没食子酸的含量，其鉴别和含量测定的指标单一、专属性差。

地榆皂苷Ⅰ是地榆药材中的一个主要化学成分，现有资料表明，地榆皂苷Ⅰ具有一定的造血促进作用，可明显升高红细胞和血红蛋白，治疗或预防各种贫血，尤其是骨髓造血功能低下或衰竭引起的贫血[8-10]，对治疗白细胞减少症具有一定的辅助效果。谭鹏等[11]采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法单独测定地榆升白片中地榆皂苷Ⅰ的含量，该文献单一测定地榆皂苷Ⅰ成分,不能全面控制地榆升白片的质量。本实验首次建立了反向高效相色谱波长切换法同时测定地榆升白片中没食子酸和地榆皂苷Ⅰ的含量，同时首次建立了制剂中地榆皂苷Ⅰ薄层定性鉴别方法，并对制剂中没食子酸薄层鉴别方法进行了优化。

1 仪器与试药

SSI series 1500高效液相色谱仪，紫外检测器，CSChrom Plus色谱工作站；色谱柱Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm，GL Sciences lnc.)；KQ-600DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，40 KHz，600 W)；十万分之一电子天平(瑞士奥豪斯DV-215-CD)；优普UPT系列超纯水器(成都优普电子产品有限公司)；可调式移液器(美国Thermo，Finnpipette系列，20～200 μL，100～1000 μL)。

地榆升白片(成都地奥制药集团有限公司，批号见表1)；没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：11083-201204)；地榆皂苷Ⅰ(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：D-022-150519)；碘(成都市科龙化工试剂厂，分析纯)；硅胶GF254高效薄层板、硅胶G高效薄层板(10×20 m，0.20～0.25 mm，青岛海洋化工厂分厂)；液相用甲醇为色谱级(美国J.T.Baker)；水为超纯水；碘、其余试剂为分析级。

表1 地榆升白片样品信息

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 没食子酸的TLC鉴别 取本品10片，研细，加甲醇10 mL，超声处理(150 W、40 kHz)30 min，静置，用0.22 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液[12]。另取没食子酸对照品，加甲醇制成质量浓度为1.0 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[13]，吸取上述供试品溶液、对照品溶液各5 μL，分别点于同一高效硅胶GF254薄层板上，以水-甲酸-乙酸乙酯(2∶2∶96)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中进行碘显色至斑点清晰，置紫外灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果见图1～2。

注：1.没食子酸对照品；2～13.样品。图1 11批地榆升白片TLC鉴别图谱(碘显日光下)

注：1.没食子酸对照品；2～13.样品。图2 11批地榆升白片TLC鉴别图谱(碘显254 nm下)

2.1.2 地榆皂苷Ⅰ的TLC鉴别 取本品10片，研细，加甲醇10 mL，超声处理(150 W、40 kHz)30 min，静置，用0.22 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液[12]。另取地榆皂苷Ⅰ对照品，加甲醇制成质量浓度为1.0 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[13]，吸取上述供试品溶液、对照品溶液各5 μL，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(15∶1∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果见图3～4。

注：1.地榆皂苷Ⅰ对照品；2～13.样品。图3 11批地榆升白片TLC鉴别图谱(10%硫酸显色后日光下)

注：1.地榆皂苷Ⅰ对照品；2～13.样品。图4 11批地榆升白片TLC鉴别图谱(10%硫酸乙醇溶液显色后365 nm下)

2.2 HPLC波长切换法同时测定供试品中没食子酸和地榆皂苷Ⅰ的含量

2.2.1 色谱条件 Inertsil ODS-3色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，GL Sciences Inc.)；流动相为乙腈-0.05%磷酸，梯度洗脱(0～18 min，5%～14%；18～48 min，14%～48%；48～53 min，48%；53～60 min，48%～55%；60～62 min，55%～5%)；波长切换(0～46 min，在280 nm波长下检测没食子酸；46～61 min，在210 nm波长下检测地榆皂苷Ⅰ)；流速为1 mL·min-1；柱温为30 ℃；进样量为20 μL。在上述色谱条件下，没食子酸和地榆皂苷Ⅰ色谱峰的对称因子均在0.95～1.05，理论塔板数均大于10 000，与样品中其他组分色谱峰达到基线分离，分离度均大于1.5，见图5。

注：A.没食子酸和和地榆皂苷Ⅰ对照品；B.地榆升白片制剂；1.没食子酸；2.地榆皂苷Ⅰ。图5 地榆升白片供试品和对照品液相色谱图

2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取没食子酸、地榆皂苷Ⅰ对照品适量，置同一容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品储备溶液，质量浓度分别为没食子酸1.025 mg·mL-1、地榆皂苷Ⅰ1.035 mg·mL-1。

2.2.3 供试品溶液的制备 取地榆升白片(三批混合取样)20片，除去包衣，研细，取约1.5 g，精密称定，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷至室温，再称定重量，补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 线性关系、检测限和定量限 分别精密吸取2.2.2项下制备的混合对照品储备溶液适量，加5%甲醇稀释，分别配制成含没食子酸对照品20.50、41.00、82.00、102.50、164.00、184.50 μg·mL-1，含地榆皂苷Ⅰ对照品20.70、41.40、103.50、165.60、186.30、207.00 μg·mL-1的混合对照品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定峰面积，以质量浓度X(μg·mL-1)为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，进行线性回归，得混合对照品的标准曲线和各对照品回归方程。将对照品溶液用5%甲醇不断进行稀释后分析，分别得到没食子酸和地榆皂苷Ⅰ的检测限LOD值(S/N≈3)和定量限LOQ值(S/N≈10)。地榆升白片中没食子酸和地榆皂苷Ⅰ的回归方程、相关系数(r)、线性范围、检测限和定量限。见表2，结果表明,没食子酸和地榆皂苷Ⅰ在线性范围内浓度与峰面积线性关系良好，方法灵敏度高，测试样品中没食子酸和地榆皂苷Ⅰ的含量远高于定量限。

表2 地榆升白片中没食子酸和地榆皂苷Ⅰ的线性关系

2.2.5 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液20 μL，重复进样6次，记录峰面积，结果显示，没食子酸和地榆皂苷Ⅰ的峰面积RSD值分别为0.85%、0.92%，说明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取本品适量，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24、48 h测定，计算峰面积，没食子酸和地榆皂苷Ⅰ的RSD分别为1.55%、1.60%。结果表明,供试品溶液在48 h内相对稳定。

2.2.7 重复性试验 称取同一批地榆升白片(批号：141215)6份，按2.2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定，结果显示,没食子酸和地榆皂苷Ⅰ的RSD分别为1.08%、0.77%，表明方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取已知含量的样品(批号：141215)6份，各约0.7 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入没食子酸溶液(质量浓度为1.017 mg·mL-1)0.56 mL、地榆皂苷Ⅰ溶液(质量浓度为1 mg·mL-1)1.945 mL的对照品溶液，照2.2.3项下方法制备，按2.2.1项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表3。没食子酸平均回收率为100.03%，RSD为0.58%；地榆皂苷Ⅰ平均回收率为100.14%，RSD为1.18%。表明该方法的回收率良好。

表3 没食子酸、地榆皂苷Ⅰ的加样回收率(n=6)

3 含量测定

取12批地榆升白片制剂，分别按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进行测定，计算，结果见表4。

表4 地榆升白片含量测定结果

4 分析与讨论

在展开剂的考察中也分别考察了三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(6∶4∶1)[1]、乙酸乙酯-甲醇-水(15∶1∶0.5)[12]、水-甲酸-乙酸乙酯(2∶2∶96)三种展开系统，最终没食子酸在水-甲酸-乙酸乙酯(2∶2∶96)中展开良好，地榆皂苷Ⅰ在乙酸乙酯-甲醇-水(15∶1∶0.5)展开良好。在点样量考察中，分别考察了2、5、10 μL的点样量，在5 μL时斑点清晰，不拖尾，故确定点样量为5 μL。

经DAD全波长(190～400 nm)扫描，没食子酸除末端吸收外，在280 nm处有最大吸收；地榆皂苷Ⅰ在210 nm附近有较强的末端吸收。本实验对是否需要切换波长进行了探究。结果表明，切换波长后杂质峰减少，基线稳定。故采用切换波长法，最终达到了检测灵敏度高，干扰小的目的。本研究采用同一条件下不同波长切换测定目标化合物对仪器稳定性进行考察，其中Agilent 1260和1200系列保留时间基本一致，且目标化合物达到基线分离。

本文优化了地榆升白片中没食子酸的TLC鉴别方法，并新建立了制剂中地榆皂苷Ⅰ的TLC鉴别方法，在该TLC鉴别方法下对照品和供试品斑点清晰，专属性强，方法简便。建立了高效液相波长切换法同时测定没食子酸和地榆皂苷Ⅰ的含量，该方法操作简便、重复性好。本文对地榆升白片的薄层鉴别和含量测定两方面进行质量标准提升研究，可更全面的对地榆升白片的制剂质量进行控制。

[1] WS-11020(ZD-1020)-2002，国家中成药标准汇编[G].

[2] 刘扬帆.地榆升白片预防放疗性白细胞减少症的临床观察[J].中国现代药物应用.2011，5(10)：88-89.

[3] 熊玲凡，冯觉平.地榆升白片缓解结直肠癌化疗中白细胞减少的临床研究[J].湖北中医杂志，2015，37(11)：3-4.

[4] 张晶晶.地榆升白片治疗妇科肿瘤化疗中白细胞减少症临床分析[J].中国实用医药，2014(31)：179-180.

[5] 顾冬云.地榆升白片对抗精神病药所致白细胞减少疗效观察[J].中国现代医生，2012，50(36)：92-93.

[6] 董红筠，宓余强，王敬，等.地榆升白片预防性治疗干扰素所致白细胞减少的临床观察[J].中成药，2010，32(2)：182-183.

[7] 王大光，余万祥，郭宗云.地榆升白片治疗干扰素诱发白细胞减少症临床观察[J].山西中医，2014，30(12)：33-33.

[8] 高小平，吴建明，邹文俊，等.地榆促造血作用的有效部位筛选[J].中国天然药物，2006，4(2)：137.

[9] 成都地奥制药集团有限公司.中药地榆及其提取物在制备升高红细胞和血红蛋白药物中的应用：101119740A[P].2008-02-06.

[10] 邹文俊，刘芳，吴建明，等.地榆总皂苷促进血细胞增殖效应研究[J].中草药，2012，5(43)：929-933.

[11] 谭鹏，蒲旭峰，文永盛，等.HPLC-ELSD法测定地榆升白片中地榆皂苷Ⅰ的含量[J].中药与临床，2013，4(1)：21-23.

[12] 香港卫生计划署.香港中药材标准：第六册[M].地榆.中华人民共和国香港特别行政区政府.

[13] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：四部[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

ImprovementofDiyuShengbaiTabletQualityStandard

HU Jia1，LiSha1，GUANGBing2，WANGZeyu1，QIULing1，SONGChuanxia1*，DENGYun1*

(1.PharmacyCollege，ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine；TheMinistryofEducationKeyLaboratoryofStandardizationofChineseHerbalMedicine；KeyLaboratoryofSystematicResearch，DevelopmentandUtilizationofChineseMedicineResourcesinSichuanProvince—KeyLaboratoryBreedingBaseofCo-foundedbySichuanProvinceandMOST，Chengdu611137，China；2.ChengduDi'aoPharmaceuticalGroupCo.Ltd.Chengdu610041，China)

Objective：To establish and improve the quality control standard of Diyu Shengbai tablet.Methods：TLC was used to identify the gallic acid and ziyuglycoside I，and HPLC wavelength switching method was used to simultaneously determine gallic acid sand ziyuglycoside I in Diyu Shengbai tablet.Results：The TLC spots were clear，and the method was simple with strong specificity.The calibration curves for gallic acid and ziyuglycoside were linear in the range of 20.50～184.50 μg·mL-1and 20.70～207.00 μg·mL-1，respectively.The average recovery of gallic acid and Ziyuglycoside were 100.03%(RSD 0.58%)and 100.14%(RSD 1.18%)，respectively.Conclusion：The quality standard established in this research was simple and stable，and can be used to control the quality of Diyu Shengbai tablet.

Diyu Shengbai tablet；TLC；HPLC；quality standard；gallic acid；ziyuglycoside I

2016-02-14)

国家科技部新药创制重大专项(2014ZX0920102-008)；国家自然基金国家基础科学人才培养项目(J13100340-12)；四川省青年科技创新研究团队(2015TD0028，2016TD0006)

*

宋川霞，助教，研究方向：中药有效成分分析，E-mail：2582345@qq.com； 邓赟，研究员，博士生导师，研究方向：中药化学成分与质量标准化研究,Tel：(028)6180023，E-mail：dengyun2000@hotmail.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.024