拟巫山淫羊藿种子质量标准研究与制订△

付长珍，潘俊倩，郭宝林

(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

·中药农业·

拟巫山淫羊藿种子质量标准研究与制订△

付长珍，潘俊倩，郭宝林*

(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

目的：研究和制订拟巫山淫羊藿种子质量标准。方法：通过对不同来源的14份拟巫山淫羊藿种子扦样、瘪壳率、千粒重、发芽率、含水量和生活力的研究，建立相应的检验方法，并对7份不同来源拟巫山淫羊藿种子进行检验，各项数据进行聚类分析作为分级依据的参考。结果与结论：拟巫山淫羊藿种子质量等级可以分2个，影响拟巫山淫羊藿种子品质的主要因素有：发芽率、千粒重、生活力和瘪壳率。

拟巫山淫羊藿；种子；质量；分级

拟巫山淫羊藿EpimediumpseudowushanenseB.L.Guo为小檗科淫羊藿属的一种多年生常绿草本植物，分布于贵州黔东南州、黔南州和贵阳市，尤其集中分布于贵州省黔东南州雷山县，少量分布于广西北部。该植物2月萌发新芽，3月始花，5月上旬至中旬果实和种子成熟[1]。目前淫羊藿药材资源主要来自于野生，随着用量大幅度增加，其野生资源蕴藏量逐年锐减[2]。发展栽培化是解决资源问题的根本出路，在淫羊藿属植物引种驯化和种植的起步阶段，使用的是分根繁殖，繁殖系数低，本研究组研究了解除该种淫羊藿种子形态生理休眠的方法[3]，并进行了生产应用，目前拟巫山淫羊藿在贵州雷山种植已有一定规模，但其种子却缺乏相应的质量标准。制订种子质量分级标准有助于该物种的扩大种植生产和种子的流通。本论文采集了拟巫山淫羊藿野生分布区和种植区域的十几份种子，通过对拟巫山淫羊藿种子千粒重、含水量、生活力等主要品质检验指标的研究，初步制订了拟巫山淫羊藿种子的质量分级标准。

1 试验材料

拟巫山淫羊藿分布于贵州省黔南州和黔东南州的部分地区，核心分布区在贵州省雷山县，种植区也在贵州省雷山县，共收集材料14份。据前期研究发现，拟巫山淫羊藿种子不耐干藏，采收回来的种子立即水洗搓去种阜，湿沙藏层积处理，直至播种。因而本研究以湿种子为实验对象，初始取样为沙子和种子的混合物。具体来源和编号见表1。

2 试验方法

2.1 扦样

采用徒手法扦取初次样品：(1)随机从样本容器中不同点取种子和沙子的混合物；(2)手指合拢，握紧种子，以免有种子漏出；(3)确保盛样容器干净；(4)在扦取每次初次样品时，应把手上东西刷落。然后采用“徒手减半法”分取试验样品：(1)将种子和沙均匀地倒在一个光滑清洁的平面上；(2)使用平边刮板将样品先纵向混合，再横向混合，重复混合4～5次，充分混匀成一堆；(3)把整堆种子分成两半，每半再对分一次，这样得到四个部分。然后把其中的每一部分再减半分成八个部分，排成两行，每行四个部分，合并和保留交错部分，如将第一行的第l、3部分和第2行的2、4部分合并，把留下的四个部分拿开；(4)将上一步保留的部分，再按照2，3，4个步骤重复分样，直至分得所需的样品重量为止。最后将样品与沙混合保持湿润(沙捏之成团，拍之即散)，置于室温或者室外荫凉处。高于25℃的持续时间不得多于15天，否则种子容易死亡腐烂。

2.2 瘪壳率

取ws-1，ws-7和ws-13三个编号种子各117 g送验样品作为试验样品，为沙和种子混合物，过20目筛筛去沙子，分别随机数取10×100粒种子，水选，计算其瘪壳率。再从沉水种子中随机数取4×100粒种子，用解剖刀逐粒解剖，分别记录实粒种子数和瘪壳种子数，计算瘪壳率。

2.3 生活力测定

采用四唑染色法(TTC)测定种子生活力。TTC溶液配制：用pH 6.5 ～ 7.0的磷酸缓冲溶液将2，3，5-氧化三苯基四氮唑(TTC)配成质量分数为1%的溶液，避光保存。使用时用缓冲溶液稀释至不同浓度。染色：TTC浓度设0.5%和1.0%，染色温度35 ℃，染色时间0.5、1、2、3 h。对ws-10种子进行生活力测定，将湿藏的种子沿中轴纵切(两部分均含有胚)(为了使胚的主要结构和活的营养组织暴露出来，便于四唑溶液快速而充分的渗入和观察鉴定，考察完全纵切和纵切但不完全切开两种方法)，放入培养皿中，滴入不同浓度的TTC溶液直至浸没种子，置设定温度的恒温箱中避光染色。每个处理3次重复，每重复50粒种子。另取60粒种子放入沸水中煮30 min，染色，作为参照。

2.4 重量测定

筛取沙子的种子，水洗去掉瘪壳，然后用吸水纸吸干表面水分，晾1～2 h至种子表面干爽无水湿。采用百粒法和千粒法测定ws-1，ws-7和ws-13三个编号种子的质量。(1)百粒法：试样取8或16个重复，每个重复100粒，重复间变异系数×100<4.0[变异系数=(标准差/平均值)×100]，测定值才有效，如变异系数超过上述限度，则应再测定8个重复，并计算16个重复的标准差。凡与平均数之差超过两倍标准差的重复略去不计。从8个或8个以上的每个重复的平均重量，再换算成千粒重。(2)千粒法：试样取2个重复，每重复1000粒，两重复间差数与平均数之比<5%，测定值才有效。

2.5 发芽实验

2.5.1 种子要求 经层积处理至胚长满的种子，每组3个重复，每重复100粒种子。其中胚长满的界定：随机数取30粒种子，解剖，观察胚率，45%种子胚率超过60%，即为胚长满。胚长满(胚率60%左右)的拟巫山淫羊藿种子在适宜的条件下就可以发芽了。

2.5.2 适宜发芽温度和发芽床的选择 (1)不同温度和发芽床的初选：ws-7号胚长满的种子进行发芽试验，选择10℃、15℃、20℃、25℃四个温度，选择了沙床和纸床两种发芽基质，统计发芽情况；(2)低温发芽温度筛选：取ws-10号胚长满种子，选择4 ℃、7 ℃、11 ℃、15 ℃四个温度，纸床发芽，统计了15天的发芽情况；(3)低温不同发芽床的筛选：取ws-10号种子，选择4 ℃，纸床和沙床两种发芽基质，15天的发芽结果。

2.5.3 发芽初次和末次计数时间 采用上述选定的适宜发芽床—纸床，做发芽实验(ws-10和ws-14)，开始每隔1天观察是否发芽，记录初次发芽时间，后每隔第7天统计发芽情况，至不再发芽。

2.6 含水量测定

拟巫山淫羊藿种子含水量采用低恒温烘干法和高温烘干法。具体操作如下：先将样品盒预先烘干、冷却、称重，并记下盒号，每个样品2个重复，每重复样品量约4.5 g，将试样(上述重量法测定相同处理的种子)放入预先烘干和称重过的样品盒内，再称重(精确至0.001 g)。使烘箱通电预热至110 ℃(视测定的样品数量而定，数量多温度可再调高一些)，将样品摊平放入烘箱内，迅速关闭烘箱门，再将烘箱温度调至103 ℃，使箱温在5～10 min内回升至103±2 ℃时开始计算时间，烘8±1 h。用坩埚钳或戴上手套盖好盒盖(在箱内加盖)，取出后入干燥器内冷却至室温，约30～45 min后再称重。高温烘干法与低恒温烘干法相同，首先将烘箱预热至140 ℃，把样品放入烘箱后再将烘箱温度调至130 ℃，打开箱门5-10 min后，烘箱温度须保持130～133 ℃，样品烘干时间为4.5 h。

2.7 种子分级标准研究

选取7份(ws-7、ws-8、ws-10、ws-11、ws-12、ws-13和ws-14)经层积处理完成胚后熟的种子进行了检测。徒手减半分样法分取样品；百粒法测定种子的千粒重；高温烘干3.5 h测定种子的水分含量，四唑染色法(35 ℃，0.5%TTC染色2 h)测定种子的生活力；在4 ℃下以纸床为为发芽床进行发芽实验，测定发芽率。采用SPSS11.0统计分析软件对检测结果进行K聚类分析，初步制定拟巫山淫羊藿种子的质量分级标准。

3 结果与分析

3.1 扦样

拟巫山淫羊藿湿种子千粒重在3.5～5.5 g。为保证种子粒数，选择千粒重上限为依据。而净度分析送检样品应不少于2500粒种子；送验样品总重量应超过净度分析量10倍以上。据此算出净度分析试验样品最小重量不少于15g(计算值13.75g)；送验样品总重量应超过150 g(计算值137.5 g)；种子批的最大重量1000 kg。

拟巫山淫羊藿种子于每年五月底采收后，即用水浸泡，搓去种阜(因种阜腐烂可能会引发沙藏过程中种子霉变)后按(质量比)种子：湿沙子=1∶5的比例沙藏，沙子的持水量为50～60%。

由于种子的保存方式是保湿沙藏，扦样所取的是种子和湿沙的混合物，为确保用于种子检验分析的种子量，所取沙和种子混合物的重量=150×(1+5)g，种子在沙藏过程中可能产生15-30%霉变，所以送验样品的沙和种子混合物的重量=150 g×(1+5)×1.3=1170 g。

3.2 瘪壳率

未经过水清选的供试种子ws-1，ws-7和ws-13的瘪壳率分别为65.6%，60.7%和39.5%，经水清选后，瘪壳率分别为5.2%，4.7%和2.7%，采用水清选法选取实粒种子。

3.3 生活力测定

3.3.1 染色前的准备 因拟巫山淫羊藿种子成熟时，种胚未发育完全，胚率7.9%，若采用完全纵切种子成两半，在染色过程中，种胚容易脱落不便于观察，因而采用纵切但不完全切开的处理方法。

3.3.2 染色条件的确定 从实验结果来看，拟巫山淫羊藿种子(ws-10进行预实验)胚染色较容易，1.0%TTC染色1 h胚基本都染色，染色2 h、3 h后，胚和胚乳染色都很深，二者在染色程度上差异不大，易与衰弱组织的染色混淆；0.5%TTC染色1 h有超过50%的种子染色，染色2h后胚基本都染色，且染色均匀，染色3h后，种子染色数目与染色2 h无明显差异，但颜色偏深。见图2。

图2 不同染色时间拟巫山淫羊藿种子(ws-10)生活力情况

3.3.3 生活力的鉴定标准 在染色过程中发现，除了腐烂种子，其他有胚种子皆染成鲜亮红色，因而鉴定标准确立为染色后胚乳颜色暗沉、胚部漆黑、组织软腐(图3A)和仅具粘液质(图3C右)皆为无活力；其它为有活力，见图3B，胚发育的不同阶段染色情况见图3B、C(左)、D。

图3 拟巫山淫羊藿种子种胚不同阶段的染色情况

3.4 重量测定

采用百粒重和千粒重测定结果见表2和表3，表2显示两份样品所测得的变异系数皆<4.0，说明采用百粒重法可估测千粒重，且测得的结果与直接用千粒重测得的结果无显著差异，因而选择百粒法用于重量测定，由于本论文所述拟巫山淫羊藿种子为沙藏层积处理后胚长满，可用于播种的种子，不能干燥，因此种子千粒重和含水量数据的离散性比较大。

表2 百粒法测定拟巫山淫羊藿种子千粒重

表3 千粒法测定拟巫山淫羊藿种子千粒重

3.5 发芽实验

3.5.1 适宜发芽温度和发芽床的选择(胚长满的种子)

(1)不同温度和发芽床的初选 发芽床实验，起始在20°条件下用了4个发芽床，除了纸床和沙床外，采用了滤纸覆盖和蛭石，但是发现滤纸覆盖和纸床情况非常接近，蛭石和沙床情况非常接近，所以其他温度没有用滤纸覆盖和蛭石，而选择了常用的两个发芽床。

第一批的发芽实验持续75 d，发芽结果见图4，表明10 ℃效果好于其他温度处理，纸床好于其他发芽床，但整体发芽率皆不高。

(2)低温发芽温度筛选 统计15 d内 ws-10号种子的发芽情况，结果见图5，表明4 ℃是比较理想的发芽温度。

(3)低温不同发芽床的筛选 统计15 d内 ws-10号种子的发芽情况，结果见图6，表明纸床好于沙床。

图4 拟巫山淫羊藿种子不同温度和发芽床的发芽结果(75 d)

图5 拟巫山淫羊藿种子(ws-10)不同发芽温度下纸床发芽的发芽率情况(15 d)

图6 拟巫山淫羊藿种子(ws-10)4 ℃不同发芽床发芽率情况(15 d)

参考上述实验结果，最佳发芽温度为4 ℃，结合其他研究，发芽温度定为2～4 ℃。发芽床为纸床。

3.5.3 发芽初次和末次时间 在4 ℃下，纸床作为发芽床，取ws-10和ws-14号种子进行发芽实验，第3 d、7 d，以后每7 d统计一次发芽情况。结果见图7。

图7拟巫山淫羊藿种子(ws-10、ws-14)不同时间发芽率情况

据此，可以每7 d统计发芽情况，到35 d，进入发芽平台期，因此发芽初次计数时间为第7 d，末次计数时间为35 d。

3.6 含水量测定

不同烘干法测定ws-10号拟巫山淫羊藿种子含水量结果一致，没有差异(见表4)，我们采用低温烘干法测定不同烘干时间的ws-10和 ws-7号种子的含水量如图8所示，结果表明低温烘干3.5 h可以恒重，因此最后确定用低温烘干法烘3.5 h。

表4 两种烘干法对测定拟巫山淫羊藿“ws-10”种子水分含量(n=2，P<0.05)

图8 拟巫山淫羊藿种子低温烘干种子含水量变化

3.7 种子分级标准研究

按以上方法对收集的7份样品的瘪壳率、千粒重(胚长满后)、生活力和发芽率进行了检测，检测结果如下表5。拟巫山淫羊藿种子瘪壳率20.0～60.7%，多数材料的瘪壳率低于40.0%。其中，ws-10号种子的瘪壳率最低，为20.0%；ws-7瘪壳率最高，为60.7%。千粒重(胚长满后)3.84～5.79g，ws-7千粒重最高，ws-8千粒重最低。生活力62.67～99.12%，除去ws-8生活力最低为62.67%，其余都高于90%。发芽率57.9～91.0%，ws-8发芽率最低，ws-10发芽率最高。

采用SPSS11.0统计分析软件对发芽率、千粒重、生活力和瘪壳率检测结果进行K聚类分析，以聚类中心值作为拟巫山淫羊藿种子分级标准的参考值，初步制定拟巫山淫羊藿种子质量分级标准，结果见表6。将7份拟巫山淫羊藿种子聚类分析后，划分为2个等级，其中一级有6个，二级有1个。

表5 拟巫山淫羊藿种子质量检验结果

表6 拟巫山淫羊藿种子质量分级标准

4 讨论

4.1 拟巫山淫羊藿种子质量检验方法

开展种子质量检验研究，制定种子质量标准和检验规程，是国家推进中药材规范化栽培的一项重要任务。目前，除了国家标准局已经发布的人参种子国家标准外，只有如甘草、桔梗、明党参等少数的药用植物开展了种子质量标准的初步研究[4-6]。绝大多数中药材种子没有相应的检验和质量标准，使得中药材种子质量控制受到制约。拟巫山淫羊藿的种子休眠特性和淫羊藿属其他物种具有相似性，本研究结果可以用于淫羊藿属其他物种的种子进行参考。目前，药用植物种子质量标准及品质检验研究方法主要参考农作物种子，同时结合药用植物种子自身的特性进行一定的修改。本实验从扦样、瘪壳率、千粒重、发芽率、含水量和生活力几个方面对拟巫山淫羊藿种子品质检验方法进行了研究，确定适宜的种子品质检验方法，由于拟巫山淫羊藿种子的特殊性决定了其与一般种子的检验规程有所不同，主要体现在：(1)拟巫山淫羊藿种子不耐干藏，采收回来的种子立即水洗搓去种阜，湿沙保存，其种子千粒重为湿种子的千粒重，本研究考察了胚未萌动与胚长满时种子千粒重的差异，所测样品普遍表现为，胚长满时千粒重要大，可能是不饱满种子层积过程中发生了变化；(2)样品与湿沙混合，按常规的净度分析实验来做，意义不大，由于在层积过程中会产生很多瘪壳种子，单从外形上无法与实粒种子分开，用水清选可很好地除去这类种子，因而用瘪壳率代替净度分析；(3)由于拟巫山淫羊藿种子具形态生理休眠(MPD)，需先经过层积处理，种子才能萌发。本规程采用10 ℃层积处理至胚长满，再转入4 ℃，无论供试种子胚的发育处于哪一阶段，都可按此方法来操作；(4)通过生活力的测定，发现对拟巫山淫羊藿种子来说，若无特殊原因，除了腐烂种子、胚部仅具粘液质和未成熟种子外，只要种子有胚，便具有生活力，且随着胚不断发育完全，染色也越来越容易。

4.2 拟巫山淫羊藿种子质量分级标准

K类中心聚类分析是利用数学原理的分级方法，它与其他分级方法，如平均数加减标准差法、频度划分法、正态分布线分级法、材料综合整理法有所不同，是属于数据类的平均划分，更适宜于判断物体的内在品质，在中药材种子质量标准分级当中也是一种常见的分析方法，如在金莲花、桔梗、远志、夏枯草等中药材中均有应用[7-9]。因此使用此方法制定的拟巫山淫羊藿种子分级标准更为科学、可行。本实验以发芽率、千粒重、生活力和瘪壳率4项指标初步制定了拟巫山淫羊藿种子质量的分级标准。分级方法采用最低定级原则，即任何一项指标不符合规定标准都不能作为相应等级的合格种子。在分级的4项指标中，发芽率最为重要，因其可较直接反映种子的田间出苗率。千粒重可反映种子饱满程度和种子成熟度等。而瘪壳率和种子含水量往往受到环境温度、湿度等的影响，可通过再加工如清选和干燥等或者控制这些影响因素来提高质量。本分级标准中以发芽率、千粒重2个指标为主判断种子质量。不同来源拟巫山淫羊藿种子质量差异较大，发芽率最高可达91.0%，最低有57.9%，大部分集中在70～90%之间，所以将一级种子发芽率定为85.5%以上，二级定为57.9%以上，低于57.9%的种子视为不合格种子；拟巫山淫羊藿种子千粒重在3.84～5.79 g，根据K聚类分析结果，将一级种子定为5.2 g以上，二级定为3.8 g以上，低于3.8为不合格种子；而种子生活力在62.67～99.12%之间，所以定为生活力低于62.7%视为不合格种子；瘪壳率在20.0～60.7%之间，为保证种子质量，高于48%的种子为不合格种子。

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StudyonSeedQualityStandardofEpimediumpseudowushanenseB.L.Guo

FU Changzhen，PANJunqian，GUOBaolin*

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

Objective：To study and formulate the seed quality grading standard ofEpimediumpseudowushanenseB.L.Guo.Methods：Seed quality testing methods were developed with 14 different sources，which included the test of sampling，deflated shell rate，weight per 1000 seeds，germination rate，seed moisture and seed viability.The related data from 7cases of seed specimens ofE.pseudowushanenseGuo were analyzed by cluster analysis.Results andConclusion：The seed quality grading ofE.pseudowushanenseGuo were divided into 2 grades.Germination rate，thousand-grain weight，viability and the deflated shell ratewere the primary indicators of seed quality grading.

EpimediumpseudowushanenseB.L.Guo；seed；quality；classification

2016-03-15)

国家科技重大专项——重大新药创制，中药材种子种苗和种植(养殖)标准平台项目(2012ZX0934006)

*

郭宝林，研究员，研究方向：药用植物资源和栽培；Tel：(010)57833172，guobaolin010@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.016