余甘子褐变过程中没食子酸等四种成分含量变化及分析

陈平，龚建瑜，左晓霜，华杰，马定乾，范源

(1.云南中医学院，云南 昆明 650500；2.云南中医学院 临床医学院，云南 昆明 650500)

·基础研究·

余甘子褐变过程中没食子酸等四种成分含量变化及分析

陈平1，龚建瑜1，左晓霜1，华杰1，马定乾1，范源2*

(1.云南中医学院，云南 昆明 650500；2.云南中医学院 临床医学院，云南 昆明 650500)

目的：测定并分析在相对恒温密闭贮藏条件下新鲜余甘子褐变过程中没食子酸、单宁酸、五没食子酰基葡萄糖(β-PGG)、β-胡萝卜素的含量变化。方法：将余甘子果实20 ℃条件下用棕色广口瓶密封避光储藏，每3天用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定没食子酸、单宁酸、β-PGG、β-胡萝卜素的含量及pH值和可滴定酸的变化。结果：余甘子中的没食子酸在自采摘后第19天左右含量最高，余甘子中的单宁酸、β-PGG、β-胡萝卜素在刚采摘第1天含量最高，pH值在第22天最高，而可滴定酸在第4天最高。结论：实验提示褐变过程中可滴定酸比pH值相对灵敏且与没食子酸、单宁酸、β-PGG、胡萝卜素呈相关性趋势，提示没食子酸和可滴定酸可作为褐变过程中质控指标之一，可以为余甘子果实储藏、预防褐变提供一定的参考。

余甘子；没食子酸；单宁酸；β-PGG；β-胡萝卜素；RP-HPLC

余甘子Phyllanthusemblica是大戟科(Euphorbiaceae)叶下珠属(phyllanthus)落叶乔木或灌木药用植物，生长在中国亚热带、热带部分地区，特别是干热河谷地区。余甘子作为药食两用的植物，各个部分功用广泛，涉及42种药用功效。余甘子常被应用于传统医药系统，如中国医药和阿育吠陀医学。我国中医药体系认为，余甘子味甘、酸、涩、凉，归肺、胃二经，具有清热凉血、消食健胃、生津止咳的功效，主要用于血瘀、消化不良、腹胀、咳嗽、喉痛口干等证。此外，余甘子具有补益、保肝、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗高血压、降血脂等保健作用[1-2]。

余甘子以鞣质类、黄酮类、多糖和维生素C含量较多，果实含有酚类化合物，主要为诃尼酸(chebulinic acid)、鞣花酸(ellagic acid)、3-乙基没食子酸(3-ethoxy-gallic acid)、诃子酸(chebulagic acid)、没食子酸(gallic acid)等。挥发油类物质主要有β-波旁烯(β-bourbonene)、二十四醇(tetracosano1)、二十四烷(tetracosane)、丁香油酚(eugeno1)、β-丁香烯(β-Caryophyllene)、绿原酸(Chlorogenic acid)。此外，余甘子果实中含有槲皮素(quercetin)，芦丁(rutin)，蛋白质，维生素B、B2、C及微量元素K、Zn、Mn等[3]。余甘子中主要化合物化学结构见图1。

图1 余甘子中主要化合物化学结构

没食子酸(Gallic acid)亦称五倍子酸或棓酸，是一种有机酸，可见于五倍子、漆树、茶等植物中。余甘子果实中除含有维生素、氨基酸外，还富含鞣质类成分，其中包括没食子酸，相关研究表明余甘子中没食子酸可促进胰岛素分泌，有一定的治疗糖尿病的作用[4]。此外，Mahdi Vazirian等[5]通过测定阿育吠陀和伊朗常用药方三果汤中的3味药物中没食子酸含量发现余甘子中所含没食子酸最高。单宁酸(Tannic acid)又称鞣质，单宁，鞣酸。单宁酸在药理方面有较高活性，可抗肿瘤、抗突变、抗脂质过氧化等，且其在治疗糖尿病及其并发症方面具有较高的活性。研究表明，余甘子果中单宁酸有利于增加风味品质与维生素C的保存[6-9]。五没食子酰基葡萄糖(β-PGG)，属于多酚类化合物，是水解单宁的组成部分，王维聪等[10]对44种中药中β-PGG含量进行测定，其中五倍子中β-PGG的含量最高。β-PGG具有抗氧化、抗癌、抗肿瘤、抗血管再生等活性，并且能抑制人胰岛淀粉样多肽(IAPP)的沉积，保护胰岛β细胞的作用[11-14]。余甘子中β-PGG相关报道较少。

由于余甘子贮藏过程中易发生褐变，使贮藏时间缩短，可对余甘子鲜果品质造成影响。脱落酸(ABA)是以异戊二烯为基本单位的一种15碳的类倍半萜类、具有抑制生长作用的植物激素，在植物成熟、衰老组织或进入休眠的器官中含量丰富。ABA通过类胡萝卜素途径合成，胡萝卜素前体形成胡萝卜素可作为ABA形成的中间反应前体[15]。而β-胡萝卜素作为类胡萝卜素之一，是自然界中普遍存在最稳定的天然色素之一，故本实验将β-胡萝卜素作为测定观察指标之一。

可滴定酸，又称总酸，指植物中所有酸性成分的总量，包括已离解成H+的酸的浓度与未离解的酸的浓度，因其大小可借助标准碱液滴定来求得。一般以测定果实中可滴定酸作为果实品质的标准之一，采摘后可滴定酸增加可能与果实中淀粉迅速降解形成大量的糖类进入三羧酸循环后进一步形成各种有机酸有关，随时间延长可滴定酸下降与其作为呼吸作用或转换成其他物质被消耗有关。

本实验根据余甘子的化学性质及没食子酸、单宁酸、β-PGG、β-胡萝卜素的化学特性，考察余甘子在相对密封、相对恒温条件下的褐变过程中没食子酸、单宁酸、β-PGG、β-胡萝卜素含量及可滴定酸、pH值的变化。

1 材料

1.1 材料与试剂

云南楚雄采摘的新鲜余甘子果实。乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，丙酮(分析纯)，正己烷(分析纯)，磷酸(分析纯)均购自云南丹赤贸易有限公司，纯净水。β-PGG对照品(成都普瑞法科技开发有限公司，批号：14021908，纯度：98%)、没食子酸(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201204)、单宁酸对照品(成都迈斯克医药科技有限公司，批号：130721)、β-胡萝卜素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100445)。

1.2 仪器

D2KW-D电热恒温水浴锅，Agilent1200型高效液相色谱仪(VWD检测器)，万分之一分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，酸度计[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。

2 方法

2.1 储藏方法

将适量余甘子果实用棕色广口瓶封口胶密封放入20 ℃恒温箱中避光储藏。

2.2 没食子酸、单宁酸、β-PGG、β-胡萝卜素对照品溶液的制备

精密称定没食子酸对照品0.40 mg，用50%甲醇制成40 μg·mL-1的溶液，备用。精密称取0.60 mg单宁酸对照品，用乙醇、水、丙酮(70∶29∶1)溶液溶解并定容，制备成质量浓度为60 μg·mL-1的单宁酸对照品溶液，备用。精密称定β-PGG对照品1.00 mg，用甲醇制成100 μg·mL-1的溶液，备用。精密称定β-胡萝卜素4.00 mg，用正己烷制成400 μg·mL-1的溶液，备用。

2.3 没食子酸、单宁酸、β-PGG、β-胡萝卜素供试品溶液的制备

2.3.1 没食子酸、单宁酸、β-PGG供试品溶液制备 取50 g余甘子果肉(去核)，精密称定，加入适量石英砂研磨，尽量捣碎，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，加热至70 ℃回流1.5 h。放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45 μm滤膜过滤。即得。

2.3.2 胡萝卜素供试品溶液的制备 取2.5 g余甘子果肉(去核)，置具塞锥形瓶中，锥形瓶用锡箔纸包裹已避光，加入50 mL正己烷-丙酮-乙醇(6∶3∶1)，放于避光处静置4 h后，摇晃锥形瓶静置2 min，取上层清液，用0.45 μm滤膜过滤。即得。

2.4 没食子酸含量测定方法

2.4.1 色谱条件 色谱柱为Agilent C18ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-0.2%磷酸溶液(5∶95)为流动相；检测波长：273 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：10 μL[16]。

2.4.2 没食子酸线性关系考察 精密称取对照品0.50 mg，用50 %的甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，摇匀作为储备液。按上述没食子酸色谱条件分别取2、4、6、10、12 μL进样，以没食子酸的峰面积(Y)对对照品的质量(X)进行线性回归，得方程Y=1 892.4X-68.546，r=0.996 5。结果表明：没食子酸峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为0.1～0.6 μg。

2.5 单宁酸含量测定方法

2.5.1 色谱条件 色谱柱为Agilent C18ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-水(80∶20)为流动相；检测波长为275 nm；流速：0.5 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：2.0 μL[17]。

2.5.2 单宁酸线性关系考察 精密称取对照品0.80 mg，用乙醇-水-丙酮(70∶29∶1)溶液溶解并定容至10 mL容量瓶中，摇匀作为储备液。按上述单宁酸色谱条件分别取2、4、6、8、10 μL进样，以单宁酸的峰面积(Y)对对照品的质量(X)进行线性回归，得方程Y=7 330.5X-230.66，r=0.999 3。结果表明单宁酸峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为0.16～0.80 μg。

2.6 β-PGG 含量测定方法

2.6.1 色谱条件 色谱柱为Agilent C18ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0 min：乙腈-0.1%磷酸(10∶90)，15 min：乙腈-0.1%磷酸(25∶75)，15.1 min：乙腈-0.1%磷酸(25∶75)，20 min：乙腈-0.1%磷酸(25∶75)；检测波长为281 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2.6.2β-PGG线性关系考察 精密称取对照品1.0 mg，用50 %的甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，摇匀作为储备液。按上述没食子酸色谱条件分别取13、15、17、19、21 μL进样，以β-PGG的峰面积(Y)对对照品的质量(X)进行线性回归，得方程Y=2 195.4X-48.33，r=1.0。结果表明β-PGG峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为1.3～1.9 μg。

2.7 β-胡萝卜素含量测定方法

2.7.1 色谱条件 色谱柱为Agilent C18ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-乙腈(85∶15)；检测波长为450 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2.7.2β-胡萝卜素线性关系考察 精密称取对照品4.0 mg，用正己烷溶解并定容至10 mL容量瓶中，摇匀作为储备液。按上述没食子酸色谱条件分别取13、15、17、19、21 μL进样，以β-胡萝卜素的峰面积(Y)对对照品的质量(X)进行线性回归，得方程Y=21.309X-99.941，r=0.999 8。结果表明β-胡萝卜素峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为5.2～8.4 μg。

2.8 pH值与可滴定酸的测定

取10 g去核余甘子，精密称定，加适量石英砂研匀，加20 mL蒸馏水导入三角瓶。80 ℃水浴30 min，冷却过滤，作为储备液。

用酸度计测定pH值，可滴定酸测定：取贮备液10 mL采用0.1 ml·L-1的NaOH滴定至pH=8.1，以苹果酸计(K=0.067)代入公式(1)。

TTA(%)=(A×0.1×0.067×20)/(10×D)×100

(1)

式中：

TTA—可滴定酸；

D—取储备液的体积；

A—NaOH消耗的体积。

3 结果与分析

3.1 精密度试验

精密吸取没食子酸、单宁酸、β-PGG、β-胡萝卜素对照品溶液，连续进样4次.以峰面积计算RSD值，没食子酸、单宁酸、β-PGG、β-胡萝卜素RSD值分别为0.27%、0.79%、0.03%、1.61%。精密度试验结果表明，仪器精密度良好。色谱图见图2～5。

注：A.没食子酸对照品；B.没食子酸样品。图2 没食子酸色谱图

注：A.单宁酸对照品；B.单宁酸样品。图3 单宁酸色谱图

注：A.PGG对照品；B.PGG样品。图4 β-PGG色谱图

注：A.胡萝卜素对照品；B.胡萝卜素样品。图5 β-胡萝卜素色谱图

3.2 结果分析

在恒温相对密封储存条件下，余甘子自采摘后22 d中没食子酸、单宁酸、β-PGG含量与β-胡萝卜素含量变化见表1。余甘子中的没食子酸在自采摘后第19天左右含量最高，刚采摘第1天含量最低，随着储存天数的增加，没食子酸的含量总体呈现上升的趋势(见图6)；余甘子中的单宁酸在刚采摘第1天含量最高，余甘子中的PGG在自采摘后第1天左右含量最高，到第4天左右随着储存天数的增加，单宁酸减少时PGG含量呈增加趋势，单宁酸含量增加时PGG含量呈减少趋势(见图7、8)；胡萝卜素含量在第1天含量最高，到第4天含量呈急剧下降趋势，第4天后下降趋势逐渐平稳，19 d后无法测得胡萝卜素含量(见图9)。

没食子酸含量增多，可能因为采摘后发生呼吸跃变等原因导致余甘子单宁酸、β-PGG等化合物发生分解反应，使没食子酸从这些化合物中解离、脱落，并发生褐变[18]。余甘子果实中的单宁酸是一种易水解的多酚化合物，其能水解产生没食子酸、β-PGG等中间产物，由此推测单宁酸和PGG水解产生没食子酸，使没食子酸含量增大，同时单宁酸也水解为PGG使PGG含量增加，此外，这些中间产物之间存在相互转化的可能，果实中的其他生物活性成分也可能对余甘子中单宁酸、没食子酸、β-PGG的含量变化产生相应影响。β-胡萝卜素在第1天到第4天含量变化明显，随时间增加出现平稳趋势，且19 d后无法测出β-胡萝卜素，推测其在果实成熟时作为前体物质产生脱落酸(ABA)或生成其他物质，故在余甘子采摘后测定胡萝卜素对研究余甘子褐变意义不大。

随储藏时间的增加，pH值的变化相对恒定，到22 d余甘子褐变后期时pH值最大，而在储藏第4天时，可滴定酸值达到最大(见表2)。随储藏时间增加，pH值变化与余甘子中没食子酸、β-PGG、单宁酸、β-胡萝卜素含量变化无明显相关性，而可滴定酸在第4天单宁酸急剧下降时达到最大，对β-PGG、单宁酸、β-胡萝卜素含量有一定关联性(见图10、11)。因此，认为可滴定酸、单宁酸、β-PGG在探究余甘子褐变过程时可作为早期褐变的敏感指标之一，没食子酸可作为褐变中期指标之一，研究为余甘子果实品质保证提供一定参考。

表1 没食子酸、单宁酸、β-PGG含量及β-胡萝卜素含量(n=3)

图6 余甘子中没食子酸含量变化

图7 余甘子中单宁酸含量变化

图8 余甘子中β-PGG含量变化

图9 余甘子中β-胡萝卜素含量变化

表2 pH值、可滴定酸值(n=3)

图10 余甘子褐变过程中pH值的变化

图11 余甘子褐变过程中可滴定酸的变化

4 结论

余甘子果实中含有丰富的多酚化合物，通过测定不同储存天数下余甘子中没食子酸、单宁酸、PGG、胡萝卜素的含量，得出了保证余甘子鲜果中这些活性成分的较适储存时间。本实验提示单宁酸、β-PGG可作为余甘子褐变过程中的早期质控指标，没食子酸可作为褐变中期指标之一。此外，实验认为可滴定酸测定可作为余甘子褐变产生的早期敏感指标之一，特别是可滴定酸测定作为余甘子褐变的标准比pH值测定更加准确，研究为余甘子果实开发利用及褐变防控提供一定的参考。

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ChangesandAnalysisofGallicacidTannicacidβ-PGGβ-caroteneofPhyllanthusemblicainBrowning

CHENPing1，GONGJianyu1，ZUOXiaoshuang1，HUAJie1，MADingqian1，FANYuan2*

(1.YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Kunming650500，China；2.TheFirstAffiliatedHospitalofYunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Kunming650500，China)

Objective：To determine the change of gallic acid，tannic acid，β-PGG，beta-carotene in freshPhyllanthusemblicain browning process in storage.Methods：FreshPh.emblicafruit was stored without light and with brown wide-mouth bottle at 20 ℃.Gallic acid，tannic acid，β-PGG，β-carotene，titration acid and pH value inPh.emblicawere determined by RP-HPLC every 3 days，and pH value and titratable acid were also measured.Results：Gallic acid inPh.emblicain 19 days after picking was the highest.Tannic acid，β-PGG，β-carotene inPh.emblicawas the highest.pH value was the highest at day 22.Titratable acid was the highest at day 4.Conclusion：The results suggest that titratable acid more sensitive than pH value in browning process and related to gallic acid，tannic acid，β-PGG andβ-carotene.Gallic acid can be served as one of the browning process quality control index and provide the reference forPh.emblicastorage or prevention of browning.

Phyllanthusemblica；gallic acid；tannic acid；β-carotene；β-PGG；RP-HPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.016

2015-10-31)

*

范源，教授，研究方向：天然活性产物及糖尿病治疗；E-mail：1647909799@qq.com