一测多评法测定冀南产柴胡中柴胡皂苷类成分

张洪峰，王乐，张凯，刘燕娟

(1.河北省邯郸市中心医院 药学部，河北 邯郸 056001；2.河北医科大学 第二医院 药学部，河北 石家庄 050000)

一测多评法测定冀南产柴胡中柴胡皂苷类成分

张洪峰1*，王乐1，张凯2，刘燕娟1

(1.河北省邯郸市中心医院 药学部，河北 邯郸 056001；2.河北医科大学 第二医院 药学部，河北 石家庄 050000)

一测多评；冀南产柴胡；HPLC；柴胡皂苷；相对校正因子

中药的质量评价与控制是中药现代化发展的关键问题之一，寻找科学合理的质控方法也一直是中药研究的难点。由于中药所含成分较多、临床适用于多种病症等自身的特点，多成分综合质控模式已成为中药质量评价和控制研究的热点领域。多成分分析需要的化学对照品由于价格昂贵或难以获得等多种因素，限制了该方法的推广。王智民等[1-2]借鉴经典的内标法、校正因子法、主成分自身对照法等方法的优势，建立了“一测多评”(quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS)法，即采用一个廉价、有效的对照品，对中药中多个成分进行含量测定。目前，该方法在《中华人民共和国药典》(《中国药典》)标准中有所应用[3-5]。

中药柴胡为使用量较大的大宗中药之一，其主要活性成分柴胡皂苷类化合物，是质量评价的主要指标性成分[6-7]。柴胡皂苷在酸性条件下稳定性较差，对照品制备难度较高。冀南产柴胡为柴胡道地药材，为更好地对其进行质量控制，本研究以冀南产柴胡为研究对象，以柴胡皂苷a(SSa)为对照品，确定SSa与柴胡皂苷c(SSc)、柴胡皂苷d(SSd)、柴胡皂苷f(SSf)的相对校正因子(relative correction factor，RCF)，建立了一测多评法测定其中4种柴胡皂苷的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪：岛津LC-15C泵，SPD-15C型紫外检测器、SIL-10AF自动进样器、CTO-15C柱温箱、岛津高效液相色谱LC工作站；电子分析天平：TB-215、BSA224S-CW(德国 塞多利斯)，Heal Force SMART-N纯水机(香港力康生物医疗科技控股集团)。

1.2 试药

柴胡皂苷a对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110777-201309)、柴胡皂苷d对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110778-201409)；柴胡皂苷c对照品(成都曼思特生物科技有限公司，纯度：98.8%)；柴胡皂苷f对照品(南京森贝伽生物科技有限公司，纯度：97.6%)；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

冀南产柴胡采自河北南部地区，经本文第一作者鉴定为BupleurumchinenseDC.的干燥根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：岛津Wondasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱(0～20 min，35%→40% A；20～40 min，40%→63% A；40～45 min，63%→35% A；45～60 min，35% A)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃，检测波长：210 nm。进样体积：20 μL。理论板数按柴胡皂苷a峰计算应不低于10 000。色谱图见图1。

2.2 柴胡皂苷混合对照品溶液的制备

取柴胡皂苷a、c、d、f对照品适量，精密称定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每l mL含柴胡皂苷a 0.513 mg、柴胡皂苷c 0.382 mg、柴胡皂苷d 0.426 mg、柴胡皂苷f 0.408 mg的溶液，摇匀，作为柴胡皂苷混合对照品储备液。分别精密量取上述储备液0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，作为柴胡皂苷不同质量浓度的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取本品粉末(过四号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇溶液25 mL，密塞，超声处理30 min，滤过，用甲醇20 mL分2次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取不同浓度柴胡皂苷混合对照品溶液各20 μL，进样测定，以进样量(X)与峰面积(Y)作图得标准曲线，经回归得柴胡皂苷a、c、d、f的回归方程分别为：Ya=7.545 2×105Xa+8.274 6×102，r=0.999 7；Yc=5.538 4×105Xc+1.230 1×103，r=0.999 8；Yd=7.215 6×105Xd+1.002 1×103，r=0.999 6；Yf=7.986 7×105Xf+1.356 7×103，r=0.999 5。胡皂苷柴a、c、d、f分别在0.021～0.513、0.015～0.382、0.017～0.426、0.016～0.408 μg线性关系良好。

2.4.2 精密度试验 精密吸取同一柴胡皂苷混合对照品溶液20 μL，连续进样6次，记录柴胡皂苷a、c、d、f的峰面积，计算各对照品RSD分别为0.78%、1.12%、0.98%、1.09%，表明所用仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一冀南产柴胡供试品溶液20 μL，分别于0、2、4、8、12、18、24 h进样，记录柴胡皂苷a、c、d、f峰面积，计算RSD。结果各对照品峰面积的RSD分别为1.25%、1.56%、1.72%、1.59%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批样品，按照2.3项下方法制备6份供试品溶液，分别精密吸取20 μL注入高效液相色谱仪，测定柴胡皂苷a、c、d、f峰面积。结果各成分含量的RSD值分别为1.29%、1.02%、1.15%，1.57%，表明该方法重复性较好。

2.4.5 准确度试验 取同一批样品6份，每份约0.25 g，精密称定，按样品含量的100%的量加入相应比例的对照品，按照2.3项下方法制备供试品溶液，测定并计算柴胡皂苷a、c、d、f的加样回收率及RSD。结果各成分回收率分别为99.78%、102.56%、101.91%、98.68%，RSD分别为1.44%、1.25%、1.76%、1.57%，表明该方法的准确度良好。

2.5 校正因子确定及其耐用性试验

2.5.1 校正因子确定 取2.2项下不同浓度柴胡皂苷混合对照溶液，按上述色谱条件分别进样20 μL，测定柴胡皂苷a、c、d、f峰面积。参照王智民等提出相对校正因子计算公式计算待评价成分柴胡皂苷c(SSc)、柴胡皂苷d(SS d)、柴胡皂苷f(SSf)与内参物柴胡皂苷a(SSa)间的相对校正因子[1]，结果见表1。

2.5.2 不同色谱柱考察 采用Shimadzu LC-15C高效液相色谱仪，考察了不同品牌色谱柱对柴胡皂苷相对校正因子的影响，结果表明SSc、SSd、SSf与内参物SSa间的相对校正因子重现性良好(RSD<5%)，见表2。

2.5.3 不同仪器考察 采用Wondasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，考察了3种不同品牌高效液相色谱仪对柴胡皂苷相对校正因子的影响，结果表明SSc、SSd、SSf与内参物SSa间的相对校正因子重现性良好(RSD<5%)，见表3。

表3 不同仪器对相对校正因子的影响

2.5.4 柱温微小变化考察 采用Shimadzu LC15C高效液相色谱仪和Wondasil C18色谱柱，考察不同柱温(30、35、40 ℃)对柴胡皂苷相对校正因子的影响，结果SSc、SSd、SSf与内参物SSa间的相对校正因子重现性良好(RSD<5%)，见表4。

表4 不同柱温对相对校正因子的影响

2.5.5 流速微小变化考察 采用Shimadzu LC15C高效液相色谱仪和Wondasil C18色谱柱，考察不同流速(0.9、1.0、1.1 mL·min-1)对柴胡皂苷相对校正因子的影响，结果SSc、SSd、SSf与内参物SSa间的相对校正因子重现性良好(RSD<5%)，见表5。

表5 不同流速对相对校正因子的影响

2.5.6 检测波长考察 采用Shimadzu LC15C高效液相色谱仪和Wondasil C18色谱柱，考察不同检测波长(206、208、210、212、214 nm)对柴胡皂苷相对校正因子的影响，结果SSc、SSd、SSf与内参物SSa间的相对校正因子重现性良好(RSD<5%)，见表6。

表6 不同检测波长对相对校正因子的影响

2.6 QAMS法与外标法测定结果比对

采用QAMS法及外标法对所收集的12批冀南产柴胡中4种柴胡皂苷含量进行测定并比较，验证所建立的QAMS法用于柴胡皂苷类成分质量评价的准确性。结果表明，与外标法相比，QAMS法测得的柴胡皂苷类成分含量无明显差异，表明所建立的方法可信度较高，见表7。采用SPSS 19.0软件对QAMS法与外标法得到的柴胡药材SSc、SSd和SSf含量进行t检验，结果表明两种方法测得含量无统计学差异(P>0.05)。

表7 冀南产柴胡4种柴胡皂苷含量测定结果 (%)

3 讨论

柴胡皂苷a是柴胡中主要的有效成分[8]，对照品较容易获得且来源有保证，选为内参物，使得所建立QAMS法更容易推广使用。课题组在前期冀南产柴胡指纹图谱研究中，通过方法学及耐用性考察确定相对保留时间值tSSc/SSa=0.410、tSSd/SSa=1.656、tSSf/SSa=0.454，本研究采用相对保留时间对SSc、SSd和SSf色谱峰定位。本研究结果表明采用QAMS法与外标法测定4种柴胡皂苷无显著差异，说明本实验所得的SSa对SSc、SSd和SSf的相对校正因子具有普遍适用性。在本实验条件下，通过SSa对照品可同时测定4种柴胡皂苷含量，操作简便、费用较低，可在柴胡药物制品中推广应用。

QAMS法是将内标法结合中药指纹图谱提出的含量测定方法，也是2015年版《中国药典》品种修订中重点推广的技术[9]。建立QAMS法关键是考察在同一色谱条件下，供试品色谱峰的数量及保留时间受仪器、色谱柱填料及流动相系统等多种因素影响，其中对各检测成分峰准确定位是核心问题。QAMS法作为一种较新的含量测定方法，在不同中药的应用及相对较正因子与所测化合物结构之间的关联等问题仍需深入研究。

[1] 王智民，钱忠直，张启伟，等.一测多评法建立的技术指南[J].中国中药杂志，2011，36(6)：657-658.

[2] 赵倩，冯伟红，张启伟，等.“一测多评”法用于栀子金花丸多成分含量测定的可行性研究[J].中国中药杂志，2014，39(10)：1826-1833.

[3] 冯伟红，杨菲，王智民，等.一测多评法与外标法测定双黄连制剂中黄酮类成分含量的比较分析[J].中国药学杂志，2012，47(20)：1665-1669.

[4] 王超群，贾秀虹，陈季，等.中药三七“一测多评”质量控制方法的系统研究[J].中国中药杂志，2012，37(22)：3438-3445.

[5] 陈静，王淑美，孟江，等.一测多评法测定苦参中5 种生物碱的含量[J].中国中药杂志，2013，38(9)：1406-1410.

[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：280.

[7] 张国松，张馨予，封传华，等.高效液相色谱-紫外检测法同时测定北柴胡中柴胡皂苷a、b2、c、d、f含量[J].中国中医药信息杂志，2014，21(5)：74-77.

[8] 黄伟，孙蓉.柴胡皂苷类成分化学与药理和毒理作用研究进展[J].中药药理与临床，2010，26(3)：71-74.

[9] 王钰莹，冯伟红，杨菲，等.“一测多评”法测定三黄片中的大黄蒽醌类成分[J].中国中药杂志，2012，37(2)：212-217.

DeterminationofFourSaikosaponinsinBupleurumchinenseofSouthHebeiProvincebyQAMS

ZHANG Hongfeng1*，WANGLe1，ZHANGKai2，LIUYanjuan1

(1.DepartmentofPharmacy，HandanCentralHospital，Handan056001，China；2.DepartmentofPharmacy，TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shajiazhuang050000，China)

Objective：To establish a quality evaluation method，quantitative analysis of multi-component with a single-marker(QAMS)to determine the contents of four saikosaponins inBupleurumchinenseof south Hebei province.Methods：Saikosaponin a(SSa)was used as the internal reference substance，the relative correlation factors(RCFs)of saikosaponin c(SSc)，saikosaponin d(SSd)and saikosaponin f(SSf)to SSa were calculated and evaluated.The contents of four saikosaponins were determined by the QAMS and external standard method.Rationality and repeatability of the QAMS method was verified by t-test between the results obtained from the two different methods.Results：Relative correction factors(RCFs)of SSC，SSd and SSf to SSa inB.chinenseof south Hebei province were 0.75，0.97 and 1.08.The both methods show no significant difference in results(P>0.05).Conclusion：The QAMS method can be used for quantity of saikosaponins inB.chinenseof south Hebei province.

QAMS；BupleurumchinenseDC.；HPLC；saikosaponins；relative correlation factor(RCF)

2015-12-17)

*

张洪峰，主任药师，研究方向：医院药学，E-mail：1388097@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.013