文冠果叶多糖超声辅助提取工艺及其药效学初步研究△

张严磊，施欢贤，雷莉妍，宋忠兴，唐志书

(陕西中医药大学陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083)

·中药工业·

文冠果叶多糖超声辅助提取工艺及其药效学初步研究△

张严磊，施欢贤，雷莉妍，宋忠兴，唐志书*

(陕西中医药大学陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083)

目的：以文冠果叶为原料，研究超声辅助法对文冠果叶多糖提取得率的影响。在此基础上，对文冠果叶多糖抗癌、抗氧化活性进行初步研究。方法：单因素试验基础上采用正交试验法研究温度、料液比、超声功率对文冠果叶多糖得率的影响，进一步优化超声提取的工艺；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)研究文冠果叶多糖对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用；抗氧化活性通过DPPH·清除实验检测。结果：文冠果叶多糖的最佳提取工艺为提取温度90 ℃，料液比为1∶20，超声功率90 W，超声时间30 min，在该条件下文冠果叶多糖的提取率可达17.90%；活性研究显示，在浓度2.5 mg·mL-1时，文冠果叶多糖对人肝癌细胞HepG2增殖抑制率为20.21%；浓度为0.2 mg·mL-1时，对DPPH·自由基清除率高达90.78%。结论：超声辅助提取文冠果叶多糖与传统的水热提取法相比，提取时间短、收率高；文冠果叶多糖具有一定的抗肝癌活性及良好的抗氧化活性，具有开发为药品及化妆品等相关产品的潜能。

超声辅助；文冠果叶多糖；药效学；初步研究

文冠果XanthocerassorbifoliaBunge是无患子科(Sapindaceae)，属木本油料植物，该植物较特殊，是一属一种，为中国特有的民间植物[1]。文冠果原产中国西北，其叶[2]、花[3]、果壳[4]、果柄[5]、种皮[6]等皆含有多种化学成分，有抗风湿、祛风、消肿止痛等功能，临床上主要用于治疗风湿性关节炎等[7]。最近研究表明，文冠果壳提取物有改善记忆的功能，进一步研究发现，主要活性物质为文冠果壳苷[8]。

但是文冠果目前最广为人知的特点是种仁含油量高、油营养价值高且具备开发为生物柴油的品质[9]。因此，近年来，国家将文冠果作为木本油料作物大力推广，重新引燃了各地对文冠果栽种热情。目前大规模的栽种区域主要在甘肃、陕西、辽宁及内蒙古，栽种面积保守在27万公顷以上[10]。对文冠果资源的开发利用目前主要有：生产种仁售卖及种仁榨油；文冠果嫩叶加工茶叶售卖。从目前调研来看，存在诸多问题：第一，文冠果种仁的售价普遍较高且销量较少，种仁一部分被科研单位购买用于研究，还有一部分用于育种栽培；第二，文冠果种仁油被证明具有多种对人体有益的功能，但其售价高且市场认可度低，因此市面很少有售；第三，文冠果叶茶据宣传有多种保健功能，诸如降压、降血糖等，但是几乎无药理实验数据及相关文献可查，加上民众对其认知度不高，产品单一，导致市面上亦难觅其踪影。这样的情况导致的结果：一方面国家大力推广栽种，栽种面积已成一定规模，但是种子却大量积压，栽种没有收益大大打击种植户及相关企业信心；另一方面市场却很少见到文冠果相关产品。

由此可见，发展文冠果产业，目前最迫切的任务是对文冠果加大研发力度，阐明其各种药理作用，开发相关产品，以研发带动栽种与销售市场。

植物多糖是近年来中药研究的热点领域，多糖的多种生物活性不断被发现，有抗癌、降血糖、调节免疫、保肝护肝等多种功能[11]。从植物中提取多糖并研究其功能也是目前研究的热点之一。与传统的水热提取法相比，超声、微波等手段应用于中药及天然产物提取方面具有提取效率高、良好的活性保持等优点，因此在多糖提取中被广泛使用，是提取领域的新方法与新趋势[12-13]。

鉴于以上原因，本文研究超声辅助水热法提取文冠果叶多糖，并通过单因素和正交试验优化提取工艺；在此基础上，对文冠果叶多糖进行抗肝癌、抗氧化活性的初步研究。研究结果为文冠果资源的综合开发和利用提供新的思路，也为文冠果叶的开发提供理论基础与参考。

1 仪器与试药

1.1 药材

新鲜的文冠果叶由杨凌普天农业科技有限公司提供，通风处阴干、粉碎过4目筛备用。

1.2 细胞株

HepG2人肝癌细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.3 试药

DMEM培养基(美国HyClone公司)；胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司)；双抗(北京索莱宝科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶(美国HyClone公司)；抗坏血酸(Vc)(成都科龙化工试剂)；1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH·)标准品(Sigma公司)；1.10-邻二氮菲(一水)(成都科龙化工试剂)；95%乙醇、无水乙醇、去离子水等试剂及溶剂均为分析纯。

1.4 仪器

UV-2600紫外分光光度计(日本岛津)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；Zirbus Technology LTD-Vaco真空冷冻干燥机(香港嘉盛科技有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 实验

2.1 提取工艺

干燥、粉碎的文冠果叶5 g，加石油醚脱脂，加入95%乙醇脱色素，加入相应比例的纯净水(一定的温度和超声频率)提取30 min，抽滤，滤液浓缩至原液的五分之一，加入4倍体积无水乙醇，4 ℃静置过夜，抽滤，滤渣醇洗，冷冻干燥称重。

文冠果叶多糖得率(%)=文冠果叶多糖质量(g)/干燥文冠果叶质量(g)×100%。

2.1.1 单因素试验 时间对文冠果叶多糖得率的影响：每份文冠果叶分别超声辅助提取10、20、30、40、50、60 min，料液比为1∶25，提取温度为50 ℃，超声频率为50 W。

料液比对文冠果叶多糖得率的影响：每份文冠果叶分别加入料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的纯净水，提取温度50 ℃，超声频率为50 W。

温度对文冠果叶多糖收率的影响：每份文冠果叶温度分别为25、40、50、60、70、80、90 ℃，料液比1∶25，超声频率为50 W。

超声频率对文冠果叶多糖提取得率的影响：每份文冠果叶粉超声频率分别为40、50、60、70、80、100 W，料液比为1∶25，温度为50 ℃。

提取次数对文冠果叶多糖得率的影响：每次提取后更换溶剂，最后合并总提取液，每份文冠果叶分别提取1次、2次、3次、4次，每次40 min，料液比为1∶25，超声频率为50 W，温度为50 ℃。

2.1.2 正交试验设计 在单因素试验结果的基础上设计正交试验，因素及水平见表1。

表1 正交试验因素及水平

2.2 文冠果叶多糖药效学的初步研究

2.2.1 抗肝癌活性研究 HepG2细胞的培养：将HepG2细胞置于25 mL塑料培养瓶中，加入完全高糖DMEM培养基(含10% 胎牛血清，100 U·L-1青霉素和100 U·L-1链霉素)，置于37 ℃含5%的CO2的恒温培养箱内。待细胞生长至90%汇合时，用0.25%的胰酶消化传代，3 d传代1次。

MTT法检测细胞相对存活率：HepG2细胞以1×104个/每孔的密度接种于96孔板中，培养12 h，使细胞充分贴壁。弃去培养基，加入文冠果叶多糖。在细胞培养结束前4 h，每孔加入15 μL的MTT。培养结束后，吸去培养基，每孔加入150 μL的DMSO，37 ℃震荡10 min，用多功能酶标仪检测450 nm处的吸光度值。

2.2.2 抗氧化活性研究 DPPH·标准溶液的配制：精密称取DPPH·标准品12 mg，用甲醇溶解并定容至250 mL，低温避光保存，备用。临用前将用甲醇稀释2倍，测量其吸光度。

Vc及样品的溶液的制备：分别量取抗坏血酸和样品25 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶。分别精密量取上述溶液适量，依次用甲醇稀释至质量浓度分别为0.01、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 mg·mL-16个梯度的样品溶液。

计算方法：取2 mL的DPPH·标准液与2 mL甲醇溶液混匀，常温避光反应15 min，于517 nm处测量吸光度(A空白)，用各浓度样品溶液代替甲醇测量其吸光度(A样)，阳性对照参照样品方法。

DPPH·清除率=(A空白-A样)/A空白×100%

3 结果与分析

3.1 超声时间对文冠果叶多糖提取率的影响

由图1可知，在料液比为1∶25，温度为50 ℃，超声频率为50 W的条件下，文冠果叶多糖的得率随提取时间变化比较大，提取时间大于40 min后，得率基本不再增加，因此选择40 min为实验时间。

图1 时间对文冠果叶多糖提取率的影响

3.2 超声次数对文冠果叶多糖得率的影响

由图2可知，在料液比为1∶25，温度为50 ℃，超声频率为50 W的条件下，文冠果叶多糖的得率随提取次数只有些许增加，几乎可以忽略不计，且考虑到增加提取次数对溶剂回收带来能源浪费等麻烦，因此提取1次即可。

图2 提取次数对文冠果叶多糖得率的影响

3.3 料液比对文冠果叶多糖提取率的影响

由图3可知，在温度为50 ℃，超声频率为50 W的条件下，当料液比大于1∶15时，得率依然随着料液比增加而增加，但是增加趋势变缓，且料液比越大，后续浓缩困难，因此选择1∶15为提取实验的料液比。

图3 料液比对文冠果叶多糖得率的影响

3.4 温度对文冠果叶多糖得率的影响

由图4可知，在料液比为1∶25，超声频率为50 W的条件下，当温度高于80 ℃后得率基本不再增加，趋于稳定，故而选择80 ℃为实验温度。

图4 温度对文冠果叶多糖得率的影响

3.5 超声频率对文冠果叶多糖得率的影响

由图5可知，在料液比为1∶25，温度为50 ℃的条件下，当超声频率大于80 W后得率增加趋于稳定状态，因此确定80 W为超声辅助的实验频率。

图5 超声频率对文冠果叶多糖得率的影响

3.6 正交试验

正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果

正交试验结果显示，各条件对文冠果叶多糖提取得率影响大小的的主次顺序为A>B>C>D，结合各因素的K值大小，优选出的文冠果叶多糖提取的最佳工艺条件为A3B3C3D1，即：提取温度90 ℃，提取料液比为1∶20，提取的超声频率90 W，提取时间30 min。

3.7 正交试验最佳条件验证

按最佳条件A3B3C3D1，进行文冠果叶多糖超声辅助提取重复验证试验，结果显示，最佳条件下文冠果叶多糖的提取得率可达17.90%，而传统水热法提取效率大大低于超声辅助法，见表3。

表3 最佳条件及水热法条件下文冠果叶多糖提取试验

3.8 文冠果叶多糖的药效学初步研究结果

3.8.1 文冠果叶多糖对人肝癌细胞HepG2存活率抑制作用 见图6。

由图6可知，文冠果叶多糖对人肝癌细胞HepG2活性具有一定的抑制作用，但是效果不明显，在质量浓度为2.5 mg·mL-1时，抑制率为20.21%。

3.8.2 文冠果叶多糖对DPPH·自由基清除活性 由图7可知文冠果叶多糖对DPPH·自由基有较强的清除活性，且具有量效关系，在质量浓度为0.2 mg·mL-1时对DPPH·自由基清除率就可达90.78%。

图6 抑制人肝癌细胞HepG2活性

图7 清除DPPH自由基活性结果

4 讨论

本文研究结果显示，超声辅助能大大提高文冠果叶多糖的提取效率，是文冠果叶多糖提取的一条高效途径。体外活性研究结果表明，文冠果叶多糖具有一定的抗癌活性，但活性不明显，而其抗氧化能力较强，具有开发为药品及化妆品等相关产品的潜力。本研究结果为文冠果资源的综合开发与利用提供了新的思路。

[1] 周荣汉.中药资源学[M].北京：医药科技出版社，1993.

[2] 马养民，王佩，文冠果叶化学成分的研究[J].中成药，2010，32(10)，1750-1753.

[3] 赵丹丹，李丹毅，华会明，等.文冠果花中一个新的单萜类化合物[J].中药，2013(1)：11-15.

[4] 李占林，李丹毅，李铣，等.文冠果果壳中一个新生物碱[J].药学学报，2006，41(12)：1197-1200.

[5] 李巍，李铣.文冠果果柄的化学成分研究[J].中草药，2008，39(3)：334-337.

[6] 王颖，潘英，邢亚超，等.文冠果种皮化学成分的分离与鉴定[J].中国药物化学杂志，2013(5)：397-399.

[7] 纪雪飞，刘新霞，吴喆，等.文冠果壳提取物对β-淀粉样蛋白致动物学习记忆障碍的改善作[J].沈阳药科大学学报，2007，24(4)：232-237.

[8] 商辉，孙妍.文冠果的化学成分和药理作用研究进展[J].中国药房，2015，26(30)：4316-4320.

[9] 暴雪，高英，玉荣，等.柱前衍生化-HPLC法测定文冠果种仁油中脂肪酸含量[J].北方药学，2012，9(1)：3-4.

[10] 申登峰.甘肃省文冠果产业发展分析[J].草业科学，2010，27(5)：157-160.

[11] 马红樱，张德，胡春香，等.植物活性多糖的研究进展[J].西北师范大学学报：自然科学版，2004，40(3)：112-117.

[12] 赵鹏，欧莉，张丽华，等.超声辅助提取葛根多糖工艺研究[J].医药导报，2009，28(10)：1338-1339.

[13] Cai-ping Zhu，Xi-chuan Zhi，Lin-qiang Li，et al.Response surface optimization of ultrasound-assisted polysaccharides extraction from pomegranate peel[J].Food Chemistry，2015(177)：139-146.

StudyonUltrasonicAssistedExtractionTechnologyandPreliminaryPharmacodynamicsResearchofPolysaccharidefromXanthocerassorbifoliaLeaf

ZHANG Yanlei，SHIHuanxian，LEILiyan，SONGZhongxing，TANGZhishu*

(ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofIndustrializationofTraditionalChineseMedicineResources；ShaanxiKeyLaboratoryofNewDrugsandBioactiveConstituentsofTraditionalChineseMedicineXianyang，Shaanxi712083，China).

Objective：To study the effect of the ultrasonic assisted extraction on extraction rate of polysaccharide inXanthocerassorbifoliaBunge leaf，and the antioxidant and antitumor activity of the polysaccharide.Methods：On the basis of single factor experiment，orthogonal experiment method was used to study the effects of temperature，ratio of solid to liquid ratio，ultrasonic power extraction time on the yield ofX.sorbifolialeaf polysaccharide.MTT method was used to study the Inhibition effect of the polysaccharides on the proliferation of human hepatoma cell line HepG2.The antioxidant activity was tested by DPPH-clearance test.Results：The best extraction process of polysaccharides ofX.sorbifolialeaf was：extraction temperature of 90 oC，solid to liquid ratio of 1：20，ultrasonic power 90W，ultrasonic time 30min，under this conditions the polysaccharide extraction rate could reach 17.90%.The inhibitory effect ofX.sorbifolialeaf polysaccharides on the proliferation of human hepatoma cell line HepG2 rate was 24.07%，when the concentration was 2.5 mg/ml.When the concentration was 0.2 mg/ml.The free radical DPPH elimination rate could be as high as 90.78%.Conclusion：Compared to the traditional hot water extraction method，ultrasonic assisted extraction method shows properties of shorter time and higher yield.The polysaccharide extracted fromX.sorbifolialeaf had certain anti-tumor activity and good antioxidant activity，which had the potential to be developed as medicines and cosmetics.

Ultrasonic assisted extraction；Xanthocerassorbifolialeaf polysaccharide；pharmacodynamics；preliminary study

2016-01-22)

陕西省协同创新计划项目(2015xt-52)；陕西省科技资源开放共享平台项目(2015FWPT-01)。

*

唐志书,教授，研究方向：中药资源化学；E-mail:tzs5656@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.023