HPLC法同时测定十味玉泉片中4种有效成分

范桂强，宋更申，张李莉，庞红霞

(1.河北省衡水市食品药品检验检测中心，河北 衡水 053000；2.河北省药品检验研究院，河北 石家庄 050011)

HPLC法同时测定十味玉泉片中4种有效成分

范桂强1*，宋更申2，张李莉1，庞红霞1

(1.河北省衡水市食品药品检验检测中心，河北 衡水 053000；2.河北省药品检验研究院，河北 石家庄 050011)

目的：建立高效液相色谱法同时测定十味玉泉片中葛根素、甘草苷、甘草酸铵和五味子醇甲4种有效成分的含量。方法：色谱柱为ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液进行梯度洗脱；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长(0～8 min在250 nm波长下检测葛根素，8～14 min在276 nm波长下检测甘草苷，14～25 min在250 nm波长下检测甘草酸铵，25～40min在216 nm波长下检测五味子醇甲)。结果：4个有效成分的线性范围分别为葛根素 68.05～680.5 μg·mL-1(r=0.999 9)、甘草苷22.06～220.6 μg·mL-1(r=0.999 8)、甘草酸铵24.98～249.8 μg·mL-1(r=0.999 4)、五味子醇甲2.184～21.84 μg·mL-1(r=0.998 9)，平均加样回收率分别为98.83%、97.84%、98.09%、97.20%，RSD分别为0.71%、0.69%、0.80%、0.99%(n=6)。结论：该方法简便、准确、灵敏度高、重复性好，可用于同时测定十味玉泉片中上述4个有效成分的定量测定，控制产品质量。

高效液相色谱法；十味玉泉片；葛根素；甘草苷；甘草酸铵；五味子醇甲

十味玉泉片由天花粉、葛根、甘草、人参、地黄、麦冬、茯苓、乌梅、黄芪和五味子十味中药制成，该药具有止渴生津、清热除烦、养阴益气之功能，主治气阴不足、口渴多饮、消食善饥等糖尿病属上述证候者。现行标准[1]对葛根主成分葛根素进行了含量控制。处方中甘草[2](主成分甘草苷和甘草酸铵)补脾益气、清热解毒；五味子[2](主成分五味子醇甲)收敛固涩、益气生津。为了更好地控制产品质量，本文采用HPLC法同时对上述3种药材中的4种有效成分进行定量研究，此法操作简便，专属性强，重复性好，可作为十味玉泉片的质量控制标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；DAD检测器；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XS205 DU电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。

1.2 试药

甘草苷(批号：111610-201005，含量：94.9%)、甘草酸铵(批号：110731-201418)、葛根素(批号：110752-201313，含量：95.8%)、五味子醇甲(批号：110857-201211，含量：99.9%)均来源于中国食品药品检定研究院。十味玉泉片由陕西华西制药股份有限公司提供，规格：0.65 g，批号分别为140601、150122、150428；乙腈为色谱纯；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测器：二极管阵列检测器；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速:1.0 mL·min-1；检测波长：0～7 min在250 nm波长下检测葛根素；7～15 min在276 nm波长下检测甘草苷；15～25 min在250 nm波长下检测甘草酸铵；25 min在216 nm波长下检测五味子醇甲；柱温:30 ℃；进样量:10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 系统适用性试验

分别称取葛根素、甘草苷、甘草酸铵、五味子醇甲对照品适量，置同一容量瓶中，用70%乙醇适量超声10 min使溶解，并稀释至刻度，制成质量浓度分别为0.272 1、0.088 20、0.100 4、0.008 72 mg·mL-1的混合对照溶液。取本品除去包衣，研细，称取约4片，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定重量，超声30 min后水浴加热回流1 h，放冷，补足减失重量，摇匀，滤过。按上述色谱条件进样10 μL。色谱图见图1。

注：A.对照品溶液；B.样品溶液；C.不含葛根样品溶液；D.不含甘草样品溶液；E.不含五味子样品溶液；F.不含葛根、甘草、五味子阴性空白溶液；1.葛根素；2.甘草苷；3.甘草酸铵；4.五味子醇甲。图1 各组分高效液相色谱图

葛根素、甘草苷、甘草酸铵、五味子醇甲与相邻峰分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.04，峰形良好。阴性对照色谱图在上述4种成分色谱峰位置处无干扰，理论塔板数均不低于4000。

2.3 溶液的制备

2.3.1 4种对照品储备液的制备 精密称取葛根素、甘草苷、甘草酸铵和五味子醇甲对照品适量，置同一容量瓶中，用70%乙醇适量超声10 min使溶解，稀释至刻度，制成质量浓度分别为6.805、2.206、2.498、0.218 4 mg·mL-1的储备液。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密量取2.3.1项下对照品储备液1 mL，置25 mL量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度。

2.3.3 供试品溶液的制备 取本品20片，除去包衣后精密称定，研细，称取约4片量，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定重量，超声30 min后水浴加热回流1 h，放冷，补足减失重量，摇匀，滤过。

江宁以悠久的历史文化与古都风貌著称，是著名的“六朝古都”“十朝都会”，清朝时是江南的政治文化中心之一。江宁景观一级目录和二级目录的数量与苏州相同，帝王陵如明太祖陵，园林如瞻园等，都吸引了康、乾二帝的关注。

2.3.4 阴性空白对照溶液的制备 按处方分别配制不含葛根、不含甘草、不含五味子以及不含葛根、甘草、五味子三种药材的空白制剂，按照供试品溶液的制备方法处理，制成阴性空白对照溶液。

2.4 检测限及定量限

将各对照品色谱峰测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，分别以信噪比为3∶1及10∶1时注入液相色谱仪的量确定检测限与定量限，见表2。

2.5 线性关系考察

精密量取2.3.1项下对照品储备液各1、2.5、5、7.5、10 mL，分别置于100 mL量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀。各吸取10 μL分别注入液相色谱仪，测定。以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得回归方程，见表2。结果表明，葛根素、甘草苷、甘草酸铵和五味子醇甲均在相应线性范围，所测对照品的浓度与峰面积存在良好的线性关系。

表2 4个对照组分的线性方程、相关系数及线性范围

2.6 精密度试验

精密吸取2.3.2项下对照品溶液10 μL，按照2.1项下色谱条件连续测定6次，以各自峰面积计算，四种成分的RSD分别为0.32%、0.45%、0.72%、0.56%。表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

精密称取批号为140601的十味玉泉片4 g，共6份，按2.3.3项下的方法制备供试品溶液，测定其含量。葛根素、甘草苷、甘草酸铵和五味子醇甲含量分别为3.252、1.048、1.225、0.106 mg/片，RSD分别为0.44%、0.50%、0.66%、0.63%(n=6)，表明重复性良好。

2.8 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，在0、2、4、6、8、16 h按照2.1项下色谱条件分别进样10 μL，记录色谱图。结果葛根素、甘草苷、甘草酸铵和五味子醇甲四种成分峰面积的RSD分别为0.70%、0.62%、0.73%、0.94%。表明供试液在16 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品(批号：140601，平均片重0.651 2 g)细粉适量(约为2片)，分别加入含葛根素(6.805 mg·mL-1)、甘草苷(2.206 mg·mL-1)、甘草酸铵(2.498 mg·mL-1)和五味子醇甲(0.218 4 mg·mL-1)的混合对照品储备液1 mL，按2.3.3制备供试品溶液，按2.1色谱条件进样10 μL，计算各组分平均回收率。见表3～6。

结果表明，4种成分的平均回收率均介于95%～105%，符合要求。

表3 葛根素加样回收试验(n=6)

表4 甘草苷加样回收试验(n=6)

表5 甘草酸铵加样回收试验(n=6)

表6 五味子醇甲加样回收试验(n=6)

2.10 样品含量测定

取3个批次的十味玉泉片，按2.3.3项下供试品的制备方法，按2.1项下色谱条件测定，用外标法分别计算葛根素、甘草苷和甘草酸铵和五味子醇甲的含量。结果见表7。

表7 样品含量测定结果(含量mg/片，n=3)

3 讨论

3.1 溶剂与提取方法的确定

比较了甲醇超声30 min、80%乙醇在80 ℃水浴中回流30 min、70%乙醇水浴回流1 h、50%乙醇水浴回流1 h等，发现在用70%乙醇水浴回流1 h条件下，甘草苷、甘草酸铵和五味子醇甲提取量最大，杂质较少，葛根素在用70%乙醇超声30 min时，提取量较大，故而本方法采取70%乙醇作为溶剂，并先超声再回流的提取方式，取得了满意效果。

3.2 检测波长的确定

取上述4种成分，用70%乙醇超声溶解后，利用二极管阵列检测器全波长扫描图，发现在250 nm处均能有信号相应，葛根素在250 nm、甘草苷在276 nm、甘草酸铵在250 nm、五味子醇甲在216 nm波长处有最大吸收，为使各成分都能获得最大吸收，准确定量，因此运用波长切换技术，使各个组份在其最大吸收波长处检测。

3.3 流动相的选择

实验过程中，采用甲醇-0.1%枸橼酸溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-水[2-6]等作为流动相对多组分进行洗脱，优化选择采用乙腈-0.1%磷酸水溶液进行梯度洗脱，分离良好，操作简便。

[1] 国家食品药品监督管理总局.国家药品标准：WS3-B-3173-98-2009-1[S].北京：国家食品药品监督管理总局，2014.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015.

[3] 王治平，李卫民，高英，等.HPLC同时测定黄芪葛根汤中9种异黄酮类有效成分[J].中国中药杂志，2010，35(20)：2689-2692.

[4] 范桂强，柳俊萍，颉维民，等.高效液相色谱法测定养阴清肺丸中芍药苷的含量[J].河北中医，2012，34(7)：1063-1065.

[5] 单鑫，陆兔林，毛春芹，等.HPLC同时测定复方五味含片中葛根素、甘草苷、甘草酸铵、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素[J].南京中医药大学学报，2014，30(1)：82-84.

[6] 林雪霞.RP-HPLC法同时测定升麻黄芩颗粒中黄芩苷、芍药苷和葛根素[J].中国药师，2015，18(3)：485-487.

SimultaneousDeterminationofFourActiveComponentsintheShiweiYuquanTabletsbyHPLC

FAN Guiqiang1*，SONGGengshen2，ZHANGLili1，PANGHongxia1

(1.HengshuiCentreforFoodandDrugControl，Hengshui，Hebei，053000，China；2.HebeiInstituteforDrugControl，Shijiazhuang，Hebei，050011，China)

Objective：To establish an HPLC method for simultaneous determination of four active components(puerarin；liquiritin；ammonium glycyrrhetate；schisandrin)in the Shiwei Yuquan tablets.Methods：Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)column was used with mobile phase consisting of water containing 0.1% phosphoric acid and acetonitrile in gradient mode.The flow rate was 1.0 mL·min-1，The column temperature was 30 ℃.Puerarin was detected at 250 nm，liquiritin was detected at 276 nm，ammonium glycyrrhetate were detected at 250nm，and schisandrin was detected at 216 nm.Results：There was good linear relationship between the concentration of puerarin，liquiritin，ammonium glycyrrhetate，schisandrin，and peak area within the concentration range of 68.05-680.5 μg·mL-1(r=0.999 9)，22.06-220.6 μg·mL-1(r=0.999 8)，24.98-249.8 μg·mL-1(r=0.999 4)，2.184-21.84 μg·mL-1(r=0.998 9).The average recovery(RSD)was 98.83%(0.71%)，97.84%(0.69%)，98.09%(0.80%)，97.20%(0.99%)，respectively(n=6).Conclusion：The established method is accurate，highly sensitive and well reproducible，which can be used for the determination of the four active ingredient in the Shiwei Yuquan tablets，control product quality.

HPLC；Shiwei Yuquan tablets；puerarin；liquiritin；ammonium glycyrrhetate；schisandrin

2016-02-18)

*

范桂强，副主任药师，研究方向：食品、药品检验检测研究；E-mail：sagefan@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.028