重金属Cu2+对四角蛤蜊的急性毒性及肝脏组织结构的影响

宫春光　殷蕊　孙桂清　于清海　王其增　崔健斌

摘要：在水温（12±0.5）℃、盐度27‰的环境下，研究了重金属Cu²⁺对四角蛤蜊的急性毒性效应和肝脏组织结构的影响。结果表明，Cu²⁺对四角蛤蜊24、48、96h LC₅₀分别为13.4、7.34和4.32mg/L；安全浓度分别为0.13、0.07和0.04mg/L。通过对Cu²⁺暴露在不同浓度96h的四角蛤蜊肝脏组织切片观察发现，Cu²⁺对四角蛤蜊的肝脏组织结构有明显影响，肝脏的损伤程度随着Cu²⁺浓度的增加而加深，2.59mg/L为四角蛤蜊肝脏解毒的阈值。

关键词：重金属；四角蛤蜊；急性毒性；肝脏

四角蛤蜊（Mactra veneriformis Reeve）属软体动物门，瓣鳃纲，真瓣鳃目，蛤蜊科，是我国沿海地区一种重要的经济贝类，通常生活在含泥沙较多的潮间带，在我国南北沿海均有分布，因其肉质鲜美，营养价值高，深受国内外消费者的欢迎。近几年，我国沿海地区的经济发展速度较快，随之而来的是大量工业废水和生活污水排人海洋，给海洋生态环境带来极大的负担，在诸多污染物中，重金属对海洋环境的影响尤为显著。重金属随沿岸径流排入海中后，容易在沿海的底泥中沉积，而四角蛤蜊为生活在泥沙中的底栖生物，又具有移动性差的特点，因而最易受到重金属的影响；重金属污染物可以在海洋生物体内或其某一组织中积累，通过生物富集和放大，直接或间接威胁人类的健康。在利用生物间的共生互补原理、运用生态学原理创建环境友好型养殖模式中，底栖贝类是一个重要的混养组合，通过贝类消耗掉其它养殖动物所排出的N，可以优化养殖环境，同时增加养殖效益，例如牙鲆和四角蛤蜊的池塘生态混养。国内外已进行过许多有关重金属对鱼类及底栖贝类的急性毒性研究，但有关重金属Cu²⁺对四角蛤蜊的急性毒性效应和肝脏组织结构的影响尚未见报道。笔者研究了Cu²⁺对四角蛤蜊成贝的急性毒性效应，得出了24、48和96h半致死浓度和安全质量浓度；同时研究了暴露Cu²⁺不同浓度96h的情况下，对四角蛤蜊肝脏组织结构的影响。本实验可为四角蛤蜊安全养殖和重金属生态毒理学研究提供基础性数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验对象为成体四角蛤蜊，产地河北省黄骅市。四角蛤蜊进入实验室后，暂养5d，期间定期投喂球等鞭金藻（3011），连续充气，每日换水一次，换水量100%，暂养水温在（12±0.5）℃。暂养期间贝类日死亡率低于5%后进行实验，实验前1d停止投饵，选择健康、反应灵敏、个体均匀的四角蛤蜊随机分组进行实验，实验贝类壳长（32.18±1.87）mm，壳高（28.23±1.36）mm，湿体质量（9.98±1.32）g。

CuSO₄·5H₂O为天津市科密欧化学试剂有限公司生产，含量≥99.0%，用超纯水分别配制成含有Cu²⁺质量浓度为10g/L母液，实验时根据不同浓度进行稀释。试验用水为人工配制海水，使用海水晶（天津市塘沽区海生海水晶厂出品）+双蒸水配制而来，盐度27‰，pH8.30。

1.2 实验方法

1.2.1 急性毒性预实验 使用15L水槽，加入4L配制海水和适量药物母液，混匀后放人10只四角蛤蜊，保持实验水温在（12±0.5）℃，自然光照，实验期间不换水，不充气，不投饵。每个预实验浓度做一组平行试验，同时设一个对照组，取实验数据平均值。24h、48h和96h后观察死亡情况，以多次刺激无反应、双壳张开、外套膜萎缩为判断其死亡的标准进行计数。通过预实验查明重金属离子的不引起死亡的最大浓度（ILL）和最小100%致死浓度（LC₁₀₀）。

1.2.2 急性毒性实验 经预实验，Cu²⁺对四角蛤蜊不引起死亡的ILL为0.76mg/L，LC₁₀₀为43.18mg/L。在此Cu²⁺实验浓度范围内，按照等比级数设定11个浓度组，每组设3个平行，1个对照，每个水槽内随机放人10只四角蛤蜊，实验条件与预实验条件保持一致，24h、48h和96h后观察死亡情况并及时清除死亡个体。实验重复一次，最终数据取平均值。

计算平均死亡率，再换算成概率单位，计算出实验药液质量浓度对数，求出概率单位与实验药液质量浓度对数的回归方程，求出各自的半数致死浓度（LC₅₀）；安全浓度为LC₅₀×AF，其中AF为应用系数，对于稳定且又易于在生物体内积累的污染物，其系数多选在O.01～0.05范围内。本实验中重金属离子属于难分解、积累性强的物质，AF值取O.01。

1.2.3 肝脏组织切片的制备与观察 取暴露不同浓度Cu²⁺96h的活体四角蛤蜊，解剖，取肝脏组织，用Bouin氏液固定、经自来水冲洗、梯度酒精脱水、透明、透蜡和石蜡包埋等步骤；后进行切片，切片厚度5μm；采用苏木精-伊红染色法（H.E）染色，BK5000显微镜观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 结果

2.1.1 中毒症状 不同实验浓度下四角蛤蜊的中毒反应有所不同。实验开始24h内，低于2.59mg/L浓度组的四角蛤蜊大部分都伸出了斧足和水管，而高于这个浓度组中的四角蛤蜊双壳紧闭，其中高于13.03mg/L浓度组的部分个体黏液分泌明显，最高浓度组的个体在24h全部死亡；24～48h内，2.59mg/L浓度组中的四角蛤蜊缩回了斧足和水管，同时低于此浓度实验组中的四角蛤蜊有少数伸出斧足，0.76mg/L浓度组的个体则几乎全部伸出斧足，高浓度组则双壳紧闭，刺激无反应，水中漂浮大量粘丝，拿起四角蛤蜊，可见大量粘液挂在壳面上；48～96h内，受试四角蛤蜊的中毒现象越来越严重，出现外套膜脱落现象，高浓度组的死亡率接近100%，但0.76mg/L浓度组的个体则仍有部分个体伸出斧足，但相比对照组中的四角蛤蜊所伸出的斧足相对要小。总体上，Cu²⁺浓度越高，四角蛤蜊所排黏液就越多。中毒死亡的个体一部分双壳张开，一部分双壳紧闭，但几乎均是外套膜、水管脱落。

2.1.2 急性毒性实验结果 Cu²⁺对四角蛤蜊的急性毒性实验具体结果见表1。

Cu²⁺对四角蛤蜊的半致死浓度及安全浓度见表2。

2.1.3 Cu²⁺对四角蛤蜊肝脏组织结构的影响

不同浓度Cu²⁺暴露96h对四角蛤蜊肝脏组织结构的影响见图1-8。

2.2 分析

2.2.1 重金属Cu²⁺对四角蛤蜊的急性毒性效应及毒性机理 本实验在水温（12±0.5）℃、盐度27‰的环境下，研究了重金属Cu²⁺对四角蛤蜊的急性毒性效应。结果表明，Cu²⁺对四角蛤蜊24、48、96hLC₅₀分别为13.43、7.34和4.32mg/L；安全浓度分别为0.13、0.07和0.04mg/L。王晓宇等研究了Hg²⁺和Cd²⁺对四角蛤蜊的急性毒性，96hLC₅₀分别为0.207和2.383mg/L，其中Cd²⁺的毒性比本实验的Cu²⁺低，这与重金属毒性的众多研究报道趋势（Hg²⁺>Cu²⁺>Cd²⁺）不符；但王晓宇的实验水温为（15±0.5）℃，而本实验水温为（12±0.5）℃，而多数重金属的毒性与水温呈正相关；另外，Lussier等研究了几种重金属和氰化物对巴西拟糠虾（Mysidopsis bahia）的急性毒性效应，得到了各种重金属对巴西拟糠虾的96h半数致死浓度，研究发现毒性作用大小为Hg²⁺>Cd²⁺>Cu²⁺。因而，这种现象还有待于进一步研究。

实验开始后，低浓度组的四角蛤蜊除最初受到人为刺激紧闭双壳外，2h后大部分个体都伸出了斧足和水管；而高浓度组中的四角蛤蜊则始终双壳紧闭，说明其受到Cu²⁺刺激后以闭壳的方式进行避毒。Cu²⁺是生物体必需金属元素，是许多氧化酶的组成成分，但过量的Cu²⁺进人生物体内会催化氧化酶产生大量活性氧自由基团，导致脂质过氧化；另外Cu²⁺可使多种酶类及活性因子失去活性，从而破坏生物体的酶系统，阻断其各种生化反应和新陈代谢活动，导致生物体死亡。

2.2.2 Cu²⁺对四角蛤蜊肝脏组织结构的影响 双壳贝类分布广、迁移性差、能高度富集水中污染物，因而是生物监测和毒理学最常被研究的群体之一。肝脏是四角蛤蜊的主要解毒和代谢功能器官，是重金属Cu²⁺进入其体内的主要富集部位，当Cu²⁺进人体内后会催化氧化酶产生大量活性氧自由基团而造成氧化损伤，一旦超过肝脏的解毒能力，就会对肝脏的组织结构产生不同程度的影响，其组织病理学评价可用于鉴定Cu²⁺的污染程度。

本研究发现，Cu²⁺对四角蛤蜊肝脏组织结构的影响有明显的浓度依赖性，Cu²⁺浓度越高，对肝脏的损伤就越明显。当暴露Cu²⁺0.76mg/L时，肝脏组织只有轻微损伤，表现为肝小管轻微肿胀（见图1）；但暴露Cu²⁺2.59mg/L时，肝脏组织损伤明显，表现为肝小管上皮细胞和胃粘膜层坏死、明显脱落（见图5）；而暴露Cu²⁺5.79mg/L时，肝脏组织则出现了大范围坏死，留下大面积坏死区（见图7）；暴露Cu²⁺8.69mg/L时，肝脏组织大范围坏死后已经完全失去消化腺的结构，只有部分肝小管留有轮廓（图8），此时四角蛤蜊的肝脏已完全失去其生理功能。高于8.69mg/L浓度组的四角蛤蜊在96h前已全部死亡，因此没有取样切片。从实验结果可以看出，Cu²⁺2.59mg/L浓度暴露96h时达到了四角蛤蜊肝脏解毒的阈值，高于此浓度会导致肝脏逐渐失去其代谢、解毒生理功能。

（收稿日期：2016-03-08）