盐酸倍他洛尔/蒙脱石微球滴眼剂的制备及初步刺激性考察

黄　燚，侯冬枝*，潘育方，刘　莉，桂茹艺，胡　晟，田双艳，平其能,陈燕忠

(1.广东药学院药科学院，广州　510006；2.中国药科大学药学院，南京　210009)



·药剂·

盐酸倍他洛尔/蒙脱石微球滴眼剂的制备及初步刺激性考察

黄燚1，侯冬枝1*，潘育方1，刘莉1，桂茹艺1，胡晟1，田双艳1，平其能2,陈燕忠1

(1.广东药学院药科学院，广州510006；2.中国药科大学药学院，南京210009)

目的制备新型盐酸倍他洛尔/蒙脱石微球滴眼剂并研究其初步刺激性。方法以蒙脱石为离子交换载体材料，用2种处方以O1/O2溶剂挥发法制备盐酸倍他洛尔缓释微球；对比微球的载药量和包封率等物化性能以得到最优处方，并将最优处方制备的微球制成滴眼剂以研究其初步刺激性。结果最优处方为丙烯酸树脂300mg(RS∶RL=1∶3)，柠檬酸三乙酯60mg，甘油30mg，乳化剂400mg(吐温-80∶司盘-80=1∶2)，盐酸倍他洛尔30mg，蒙脱石50mg，内外相体积比为1∶6。最优处方制得的微球载药量和包封率分别为14.31%和94.35%，初步刺激性实验显示微球滴眼剂对眼部组织无明显刺激性。结论微球制备方法简便易行，重复性好；制备的微球滴眼剂无明显刺激性，具有广阔的应用前景。

蒙脱石；盐酸倍他洛尔；微球；刺激性

青光眼是由于眼压增高而引起视盘凹陷、视野缺损，威胁视神经功能最终导致失明的严重眼病。盐酸倍他洛尔(betaxololhydrochloride，BH)是一种选择性β1受体阻滞剂，具有一定的钙通道阻滞功能，可通过减少房水的生成起到降眼压的作用，并使神经节细胞内谷氨酸盐引起的钙超载减轻，细胞凋亡减少[1]，临床上常用于治疗青光眼。但盐酸倍他洛尔滴眼液挥发迅速，起始作用可以在30min内出现，因此考虑将缓释技术用于滴眼液，希望可以有效控制其在眼部的释放，延长其在眼部的滞留时间，达到温和持久的药效[2]。蒙脱石(montmorillonite，MMT)是一类具有天然纳米粒特性的硅酸盐矿石膨润土的主要成分，具有良好的吸水膨胀性、流体触变性[3-5]、阳离子交换性[6-8]和吸附性[9-11]；此外，蒙脱石的绿色无毒性和抗紫外特性已用于化妆品和医药行业[12-13]。因此，蒙脱石作为一种新型药物载体应用于离子交换给药缓释系统，具有巨大潜力。本文以蒙脱石为离子交换载体材料，以O1/O2型乳化-溶剂挥发法制备盐酸倍他洛尔缓释微球，通过测定微球的载药量、包封率、体外释放性能和扫描电镜下微球的形态等物化性能来对比2种处方。最后将最优处方制备的盐酸倍他洛尔/蒙脱石微球制备成滴眼剂，考察其对眼部组织的初步刺激性。

1　仪器与试药

1.1仪器UV754N紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；BL-220H电子天平(日本岛津公司)；ClassicaE103G光学显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)；QUANTA400F扫描电镜(美国FEI公司)；数显恒温水浴锅(江苏金坛市宏华仪器厂)；XW-80A旋涡混合仪(海门市米其林贝尔仪器有限公司)；KQ-5200超声波清洗器(东莞市科桥超声波设备有限公司)；RCT安全型磁力搅拌器(德国IKA公司)。

1.2试药盐酸倍他洛尔(质量分数99.5%，批号20110615，济南浩化实业有限公司)；丙烯酸树脂(eudragitRS/RL，德国Degussa公司)；MMT-BH(实验室自制)；液体石蜡、正己烷、甘油、司盘-80和吐温-80等(分析纯，天津大茂试剂有限公司)。

2　方法与结果

2.1标准曲线的制备精密称取10mg盐酸倍他洛尔原料药，置于10mL量瓶中，用去离子水定容，得到质量浓度为1mg·mL-1的储备液。精密吸取储备液0.2，0.4，0.8，1.2和1.6mL，分别置于10mL量瓶中，定容至刻度，得到质量浓度分别为0.02，0.04，0.08，0.12和0.16mg·mL-1的标准溶液，在274nm处测定吸光度值A，以A值对质量浓度C作线性回归，得标准曲线方程：A=3.543 3 C+0.037(r=0.999 8)。结果表明，待测液中BH的质量浓度在0.02～0.16mg·mL-1范围内与吸光度的线性关系良好。2.2表观溶解度测定将过量的BH加入一定体积的去离子水中，涡旋5min，置于34 ℃恒温水浴中振荡，每隔30min取样200μL，稀释适当倍数并同时补充相同体积的去离子水，测定吸光度A，由标准曲线换算出药物质量浓度，当测得相邻2次时间点样品质量浓度相差不超过5%时，判断溶解达到平衡，此时质量浓度视为平衡溶解度，测定BH在水中的表观溶解度为16.94mg·mL-1。

2.3MMT-BH微球的制备处方A[14]:精密称取MMT-BH50mg，BH30mg，丙烯酸树脂(RS∶RL=1∶3)300mg，柠檬酸三乙酯60mg，甘油30mg，吐温-80 150mg和乙腈5mL。二氯甲烷(4∶1)作为内相O1；外相O2为含有300mg司盘-80的30mL轻质液体石蜡。将内相逐滴滴加到外相中，冰水浴(5～10 ℃)超声乳化5min，在800r·min-1的转速下磁力搅拌乳化10min，后将转速调至300r·min-1，室温挥发有机溶剂至溶液澄清，用正己烷清洗微球，抽滤，晾干，备用。

处方B：在内相O1中加入MMT-BH30mg，BH35mg，丙烯酸树脂(RS∶RL=1∶1)400mg，柠檬酸三乙酯80mg，甘油80mg，吐温-80 124mg和乙腈5mL；外相O2为轻质液体石蜡10mL和司盘-80 248mg的混合液。将O1缓慢滴加到O2中，冰水浴(5～10 ℃)超声乳化15min，在800r·min-1的转速下磁力搅拌乳化90min，后将转速调至650r·min-1，室温搅拌至有机溶剂挥发完全，待溶液澄清，用正己烷清洗微球，抽滤，晾干备用。

2.4盐酸倍他洛尔/蒙脱石微球物化性能

2.4.1微球形态学测定肉眼观察，2种处方制备的蒙脱石载药微球均为白色粉末，且均匀细腻；光学显微镜下观察到微球为圆整的球形，相互之间无粘连，分散性较好；扫描电镜放大后可看出处方A微球致密均匀，表面较为圆滑，无药物颗粒的吸附；处方B微球表面有颗粒析出，且整个微球的圆整性不如前者完美，见图1。

图1扫描电镜照片

A.处方A制备微球;B.处方B制备微球

Fig.1Scanningelectronmicrographs

A.microspherespreparedbyprescriptionA;B.microspherespreparedbyprescriptionB

2.4.2微球载药量和包封率的测定精密称取微球30mg，加入1mL二氯甲烷，超声使微球完全溶解，再向其中移取30mL去离子水，涡旋2～5min，34 ℃恒温振荡2h，离心，取上清液，过滤，稀释适当倍数，在274nm波长处测定其A值，代入标准曲线中计算BH的质量浓度C，并按照公式(1)和(2)计算载药量与包封率：

(1)

(2)

按照上述测定载药量和包封率的方法分别对处方A和B制备的载药微球进行测定，测得处方A的载药量和包封率分别为14.31%和64.92%，处方B的载药量和包封率分别为5.21%和64.92%。

2.4.3体外释放性能考察精密称取微球30mg，置于含有5mL人工泪液的透析袋中，扎紧透析袋两端，将透析袋置于35mL人工泪液中，在34±1 ℃水浴中恒温振荡，在规定时间精密移取5mL外相介质，并同时补充5mL新鲜介质，在274nm处测定样品吸光度。以微球的累积释放量对时间作曲线图，见图2。2.5微球滴眼剂的制备先制备质量浓度为1.5g·L-1的卡波姆934P溶液，将最优处方A制备的MMT-BH微球、质量浓度为0.1mg·mL-1的吐温-80、适量甘露醇和氢氧化钠溶液加入卡波姆溶液中，置于分散均质机中,以10 000r·min-1转速均质10min制备混悬液。制得混悬液呈白色，均匀细腻，BH质量浓度为2.790±0.006mg·mL-1，沉降体积比大于0.9，分散性良好，pH值为7.0，黏度为4.5mPa·s左右，渗透压在270～400mOsm·kg-1之间，满足眼用滴眼剂要求。

图2盐酸倍他洛尔/蒙脱石微球累积释放曲线

Fig.2ThecumulativereleasecurveofMMT-BHmicrospheres

2.6微球滴眼剂初步刺激性考察

2.6.1实验动物及药物将健康、角膜正常的家兔(广东省医学实验动物中心，动物质量合格证编号4407207133)分组并进行编号(每组3只)：第1组为空白对照组(A)，不给药；第2组为质量浓度为2.8mg·mL-1的BH水溶液组(B)；第3组为混悬液空白介质组(C)；第4组为盐酸倍他洛尔微球滴眼剂组(D)；第5组为MMT-BH混悬液组(E)；第6组为市售贝特舒组(F)。

2.6.2长期给药刺激性实验选取6只家兔，按照2.6.1项下方法对家兔进行分组。每只家兔左眼滴入供试样品，右眼滴入生理盐水作为对照，每天早晚各给药50μL，连续给药21d，在给药后1，2，4，24，48和72h对眼部组织进行检查。

2.6.3单次超剂量给药刺激性实验另取6只家兔，同样按照2.6.1项下方法对家兔进行分组。单次给药1mL，在给药后1，2，4，24，48和72h对眼部组织进行检查。

按照Draize眼部刺激性标准，0～3分为无刺激性；4～8分为轻度刺激性；9～12分为中度刺激性；13～16分为强度刺激性。角膜各项评分均为0，表明混悬剂对角膜无刺激，B组中有1只兔眼虹膜上出现皱褶加深，因而得0.3分；A组和生理盐水结膜均出现轻微充血状况，给药后充血更为严重，表明各样品对结膜均有轻微的刺激作用。长期和单次大剂量刺激实验的刺激性评分都在0～3分之间，说明盐酸倍他洛尔/蒙脱石微球滴眼剂对眼部无明显刺激性。

2.6.4眼部组织学检查将2.6.2和2.6.3项下36只家兔进行耳缘静脉注射空气处死，摘取眼球并进行各组织的剥离，用质量浓度为100g·L-1的甲醛固定24h，进行石蜡包埋切片，做常规HE染色，在光学显微镜中观察组织的细胞病变情况。结果见图3～4。

图3　家兔角膜HE切片(HE×400)

A.空白对照组；B.BH水溶液；C.混悬液空白介质；D.盐酸倍他洛尔微球滴眼剂；E.MMT-BH混悬液；F.市售贝特舒；G.盐酸倍他洛尔微球滴眼剂单次大剂量；H.MMT-BH混悬液单次大剂量；I.生理盐水

Fig.3RabbitcorneaHEsection(HE×400)A.controlgroup；B.BHsolution；C.suspensionofblankmedia；D.betaxololhydrochloridemicrosphereseyedrops；E.MMT-BHsuspension；F.betopic；G.thesinglehighdoseofbetaxololhydrochloridemicrosphereseyedrops；H.thesinglehighdoseofMMT-BHsuspension；I.normalsaline

图4结膜HE切片(HE×200)

A.空白对照组；B.水溶液；C.混悬液空白介质；D.盐酸倍他洛尔微球滴眼剂；E.MMT-BH混悬液；F.市售贝特舒；G.盐酸倍他洛尔微球滴眼剂单次大剂量；H.MMT-BH混悬液单次大剂量；I.生理盐水

Fig.4RabbitconjunctivaHEsections(HE×200)

A.controlgroup；B.BHsolution；C.suspensionofblankmedia；D.betaxololhydrochloridemicrosphereseyedrops；E.MMT-BHsuspension；F.betopic；G.thesinglehighdoseofbetaxololhydrochloridemicrosphereseyedrops；H.thesinglehighdoseofMMT-BHsuspension；I.normalsaline

由图3～4可知，正常角膜表面光滑平整，各层组织排列规则；C组角膜表面局部凹凸不平，较多上皮细胞体积增大、肿胀、变形、核周苍白且后弹力层似与内皮细胞层脱离，损伤最为严重；A组结膜亦有轻度炎症反应，表现为个别上皮细胞溶解消失；B组结膜组织上皮少量淋巴细胞浸润，商品贝特舒结膜组织内有部分淋巴细胞浸润，但D和E组只出现了与生理盐水组相当的轻度炎症反应，说明原料药溶液和贝特舒对结膜有刺激作用，且刺激程度均大于D和E组。

3　讨论

乳化溶剂挥发法是制备微球最为常见的方法。本文采用2种处方以O1/O2溶剂挥发法制备盐酸倍他洛尔/蒙脱石微球，以微球的载药量、包封率、体外释放性能和形态为指标进行物化性能的对比。其中测得最优处方A制备微球的载药量和包封率分别为14.31%和94.35%，是处方B的2.75和1.45倍；体外释放性能显示，处方B在15min时累积释放量达到43.05%，存在明显的突释；结合SEM图片，可以观察到处方B微球表面有颗粒的吸附，且整个微球的圆整性不如处方A完美；由BH在水中溶解度为16.94mg·mL-1可知，该药物为水溶性药物，且研究表明MMT具有可以减小水溶性药物微球突释的特性[15]；处方A和B在BH的用量方面差异不大，但处方A蒙脱石用量为B的1.7倍。通过以上结果探讨出：处方B制备的MMT-BH微球载药量和包封率低是因为BH被MMT吸附进去的较少，药物大多停留在微球表面；同时也证明MMT作为缓控释载体的巨大潜能。后续还需继续探讨制备微球的更好方法，争取在载药量和粒径上有更大的突破。

初步刺激性考察实验中，生理盐水组炎症反应超过实验组，这可能是由于结膜被环境中的病原微生物感染而导致结膜部位有轻微炎症。通过对兔眼眼部组织进行检查，可以得出制备的盐酸倍他洛尔/蒙脱石微球滴眼剂对眼部无明显刺激性，且刺激性明显低于市售贝特舒。这只是对兔眼进行初步刺激性考察，存在一定的局限性，后期还需要对该制剂进行细胞毒性实验、鸡胚刺激性实验以及药动学的研究。

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Studies on the preparation and irritation of betaxolol hydrochloride microspheres loaded by montmorillonite

HUANG Yi1，HOU Dongzhi1*，PAN Yufang1，LIU Li1，GUI Ruyi1，HU Sheng1，TIAN Shuangyan1，PING Qineng2，CHEN Yanzhong1

(1.College of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.College of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

ObjectiveTopreparetheeyedropsofbetaxololhydrochloridemicrospheresloadedbymontmorilloniteandtostudyitsirritation.MethodsMontmorilloniteswereusedasionexchangecarriermaterialforhydrochloridemicrospheresinthisstudy.ThebetaxololhydrochloridemicrosphereswerepreparedwithO1/O2solventevaporationmethodusingtwodifferentformulations.Toobtaintheoptimalformulations，thepreparationparameterswereinvestigated，suchasdrug-loadingrate，andtheencapsulationefficiency，etc.Theoptimalformulationwasadoptedtopreparethetheeyedropsofbetaxololhydrochloridemicrospheresloadedbymontmorillonite.Theirritationofthepreparedeyedropswasresearched.ResultsTheoptimalfomulationwasdescribedasfollows:300mgofacrylicresin(RS∶RL=1∶3)，60mgoftriethylcitrate，30mgofglycerin，400mgofemulgator(Tween-80∶Span-80=1∶2)，30mgofbetaxololhydrochlorideand50mgofmontmorillonite.Inaddition，thevolumeratioofinternalphasetoexternalphasewas1∶6.Thedrug-loadingrate，andtheencapsulationefficiencyofmicrospherespreparedbytheoptimalformulationwere14.31%and94.35%，respectively.Theirritationtestsshowedthattheeyedropshadnoobviousirritationforeyetissues.ConclutionsThepreparationofmicrospheresissimpleandreproducibleandtheeyedropshasnoobviousirritation.

montmorillonite；betaxololhydrochloride；microspheres；irritation

国家自然科学基金项目(编号：51102052)；广东省医学科学技术研究基金(立项编号：A2016275)

黄燚，女，硕士研究生

侯冬枝，女，博士，副教授

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.016

R944

A

1004-2407(2016)05-0493-04

2015-12-15)