UPLC法测定人参总皂苷提取物中7种人参皂苷的含量

蔡　艳，宋　剑，王贵金，贾继明

(石家庄以岭药业股份有限公司，石家庄　050035)



·中药及天然药物·

UPLC法测定人参总皂苷提取物中7种人参皂苷的含量

蔡艳，宋剑，王贵金，贾继明*

(石家庄以岭药业股份有限公司，石家庄050035)

目的 建立一种同时测定人参总皂苷提取物中7种人参皂苷的超高效液相色谱分析方法，该方法对人参提取物的质量评价更准确、更快捷。方法采用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；乙腈-水为流动相；检测波长：203 nm；流速:0.4 mL·min-1；测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc 和人参皂苷Rd的含量。结果测定的各色谱峰均能达到基线分离、分离度大于1.5，7种人参皂苷在各自的范围内有良好的线性关系，且RSD值符合要求。结论UPLC能代替HPLC测定人参皂苷的含量，该方法灵敏、简单、准确、重复性好。

人参皂苷；人参总皂苷；超高效液相色谱法

人参为五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根茎；具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺等功效[1]；始载于《神农本草经》，列为上品，是一种常用的滋补强壮药。人参的主要有效成分为多种人参皂苷类及多糖类成分[2]。现代药学研究证明：人参皂苷(ginsenoside)是人参中重要的活性物质，其含量高低是评价人参内在质量的重要指标之一[3]。人参多糖具有调节免疫活性和抗肿瘤活性、细胞保护和降血糖等作用[4]。据文献报道，人参皂苷有很强的抗肿瘤作用，现已发现人参皂苷Rg3、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rh2和人参皂苷Rb1等多种抗肿瘤活性成分,其中人参皂苷Rg3的抗肿瘤作用最显著，在对肿瘤的治疗研究中被广泛使用[5]。人参皂苷 Rg1和人参皂苷Rb1作为人参益智作用的主要活性成分，可通过改变脑内主要神经递质的量、信号转导途径中的蛋白分子等，改善动物的学习记忆行为能力[6]。人参皂苷Rg1是人参重要的抗衰老成分，它能有效调控NSCs 衰老，促进其增殖分化，有明确益智与延缓脑衰老的作用[7]。Chen L M等[8]研究了人参皂苷Re对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用，实验结果表明，人参皂苷Re具有较好的脑缺血再灌注损伤神经保护潜力；人参皂苷Rb2对DNA和RNA的合成具有促进作用，脑中枢调节具有抑制中枢神经、降低细胞内钙、抗氧化、清除体内自由基和改善心肌缺血再灌注损伤等作用；人参皂苷Rd主要有抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、抑制肿瘤细胞生长、提高机体免疫力和改善心脑血管等作用[9]。

目前,人参皂苷的含量测定大多是采用HPLC或HPLC-ELSD等方法，在液相色谱法测定过程中多采用梯度洗脱，虽可进行皂苷的测定，但存在分析时间长和响应值低等缺点[10]。超高效液相色谱法(UPLC)是中药研究领域发展的一个极大进步，卓越的分离度和灵敏度更适合于中药复杂样品的分析，同时减少了溶剂消耗，极大地缩短了分析时间[11]。本文采用UPLC法测定人参总皂苷提取物(树脂联用法即大孔吸附树脂和弱碱阴离子交换树脂联合使用)中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2和人参皂苷Rd 7种人参皂苷的含量。该测定方法准确、快速、重复性好[12]，有利于人参总皂苷提取物的质量控制。

1　仪器与试药

1.1仪器Waters Acquity UPLC H-Class，Waters公司；色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，Waters公司。

1.2试药大孔吸附树脂AB-8，弱碱性阴离子交换树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水。对照品均购于中国食品药品检定研究院，供含量测定用，分别为人参皂苷Rg1(批号110703-200424)、人参皂苷Re(批号110754-200822)、人参皂苷Rf(批号111719-201104)、人参皂苷Rb1(批号110704-201122)、人参皂苷Rb2(批号111715-201203)、人参皂苷Rc(批号11021-14-0)和人参皂苷Rd(批号111818-201302)。人参总皂苷提取物自制(批号：130301,130302,130303)。

2　方法与结果

2.1对照品溶液的配制分别精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2和人参皂苷Rd对照品10.1，10.0，9.5，11.7，9.9，9.8和10.1 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配成混合对照品溶液，测定前用甲醇稀释2，4，8，16和32倍，得到系列质量浓度的混合对照品溶液，备用。见表1。

表1人参总皂苷提取物含量测定液相条件

Tab.1 The extraction conditions of ginseng total saponins in content determination

时间/minA,乙腈/%B,水/%01981102575153862204258

2.2供试品溶液的制备精密称取人参总皂苷提取物30.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，备用。

2.3色谱条件色谱柱:Waters Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm);检测波长：203 nm；流速：0.4 mL·min-1；柱温：30 ℃。结果见图1。

2.4方法学考察

2.4.1线性关系考察精密吸取2.1项下不同质量浓度的人参皂苷对照品溶液2 μL，注入色谱仪，按照2.3项下色谱条件进行测定。以人参皂苷的峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程，结果显示其线性关系良好。其回归方程、线性范围及相关系数见表2。

2.4.2精密度实验精密吸取人参皂苷混合对照品溶液2 μL，连续进样6次，记录峰面积，7种皂苷峰面积的RSD值为0.83%～1.34%，说明仪器精密度良好。

图1UPLC图

A.对照品；B.人参总皂苷提取物；1.人参皂苷Rg1;2.人参皂苷Re;3.人参皂苷Rf;4.人参皂苷Rb1;5.人参皂苷Rb2;6.人参皂苷Rc;7.人参皂苷Rd

Fig.1 UPLC chromatograms

A.reference substances; B.ginseng total saponin extract；

1.ginsenoside Rg1;2.ginsenoside Re;3.ginsenoside Rf;4.ginsenoside Rb1;5.ginsenoside Rb2;6.ginsenoside Rc;7.ginsenoside Rd

表27种人参皂苷线性关系

Tab.2 The linear relationships of 7 kinds of ginseng saponins

成分回归方程线性范围/μg·mL-1r人参皂苷Rg1Y=47491X-3315612.6～404.00.9998人参皂苷ReY=48150X-3392812.5～400.00.9999人参皂苷RfY=43335X-3466411.8～380.00.9996人参皂苷Rb1Y=53367X-4546214.6～468.00.9991人参皂苷Rb2Y=43786X-3569712.2～392.00.9992人参皂苷RcY=41673X-3114812.3～396.00.9991人参皂苷RdY=45007X-3760212.6～404.00.9991

2.4.3稳定性实验将供试品溶液在1，2，4，8，12和24 h分别进样2 μL，记录峰面积，7种皂苷峰面积RSD值为0.37%～2.63%，说明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4重复性实验称取同一份样品6份，按照2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.3项下色谱条件进行测定，记录峰面积，测定含量，结果7种人参皂苷峰面积RSD值为0.67%～1.53%，说明重复性良好。2.4.5加样回收率实验精密称取已知皂苷含量的人参总皂苷提取物15 mg,共6份，分别加入一定量的各皂苷对照品溶液，按照2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.3项下色谱条件进行测定，记录峰面积，测定含量，计算回收率，结果见表3。

表3人参总皂苷提取物7种人参皂苷回收率实验结果

Tab.3 The recovery experiment results of 7 kinds of ginseng saponins　(n=6)

2.4.6样品含量测定分别取3批人参总皂苷提取物适量,精密称定， 按照2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.3项下色谱条件测定峰面积，计算含量，结果见表4。

表43批人参总皂苷提取物中7种人参皂苷的含量(%)

Tab.4 3 batches of ginseng total saponins of 7 kinds of ginseng saponin content(%) in the extract

人参皂苷提取物人参皂苷Rg1人参皂苷Re人参皂苷Rf人参皂苷Rb1人参皂苷Rb2人参皂苷Rc人参皂苷Rd13030120.411.74.224.19.28.45.113030221.111.54.824.69.08.55.413030320.311.34.524.58.48.75.2

3　讨论

2015年版《中国药典》一部中人参皂苷含量测定需要时间100 min，本文建立超高效液相色谱法的色谱条件可以在20 min内使7种人参皂苷得到很好的分离，方法灵敏、快速，为人参皂苷的质量控制提供了准确、可靠的测定方法。

作者经过大量地液相梯度洗脱条件摸索，曾采用甲醇-水、甲醇-5 mL·L-1磷酸水、乙腈-水和乙腈-5 mL·L-1磷酸水等不同洗脱系统，在乙腈-水系统下，7种人参皂苷类成分的分离度均大于1.5，且峰形较好。因此采用乙腈-水为该实验的流动相。比较25,30和35 ℃等不同温度下色谱柱的分离效果，结果表明，30 ℃下柱压较低且分离效果最佳，因此确定柱温为30 ℃。

色谱柱的选择：作者比较了Waters Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色谱柱，Waters Acquity CSH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)色谱柱和Waters Acquity HSS T3色谱柱，结果表明，Waters Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)色谱柱分离效果较好，该方法使各峰均能达到基线分离，能精确地测定人参皂苷的含量。

研究结果表明，本文建立的UPLC测定7种人参皂苷含量的方法简便、准确、重复性好、稳定性高,可以实现人参提取物的多指标质量控制,为测定人参皂苷提供了可靠的分析方法。

[1]国家药典委员会.中国药典2015年版[S]．一部．北京:中国医药科技出版社，2015:8．

[2]侯家玉．中药药理学[M]．北京:中国中医药出版社，2002:205-206．

[3]王启祥，吕修梅，张晋秀.人参皂苷含量变化研究概况[J].西北药学杂志，2002，17(5)：233-235.

[4]彭会军，邹群.植物多糖的生物活性研究进展[J].西北药学杂志，2008，23(6):406-408.

[5]段林瑞，谢艳华，王四旺.人参皂苷Rg3药代动力学及抗肿瘤作用的研究进展[J].现代生物医学进展，2010，10(4):770-773.

[6]王琼，王逸，韩春勇，等.人参皂苷Rg1、Rb1及其代谢产物益智作用的研究进展[J].中草药，2014，45(13) 1960-1965.

[7]彭彬，陈茂山，蒲莹，等.人参皂苷Rg1延缓D-半乳糖大鼠脑衰老作用及机制的初步研究[J].重庆医科大学学报，2011，36(4):419-422.

[8]Chen L M，Zhou X M，Cao Y L，et al.Neuroprotection of ginsenoside Re in cerebral is chemia-reperfusion injury in rats [J].J Asian Nat prod Res，2008，10(5/6):439-445.

[9]Liu X，Wang L，Wen A，et al.Ginsenoside-Rd improves outcome of acute ischaemic stroke-a randomized，double-blind，placebo-controlled，multicenter trial[J].Eur J Neurol，2012，19(6): 855-863．

[10]张丽娜，肖艺，魏双，等.RP-HPLC同时测定人参总皂苷粗提物中人参皂苷Re和Rh2[J].辽宁科技大学学报，2015，38(5)：355-357.

[11]Sun B S，Xu M Y，Li Z，et al. UPLC-Q-TOF-MS/MS Analysis for Steaming Times-dependent of Profiling Steamed Panax quinquefolius and Its Ginsenosides Transformations Induced by Repetitious Steaming [J]. J Ginseng Res，2012，36(3): 277-290.

[12]闫玉梅，赵梅梅，王笑笑，等.RP-HPLC法同时测定西洋参含片中4种成分[J].西北药学杂志，2016，31(1)：5-8.

Determination of 7 kinds of ginsenosides in Panax ginseng in the extract of Ginseng radix by UPLC

CAI Yan,SONG Jian,WANG Guijin, JIA Jiming*

(Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Limited Company, Shijiazhuang 050035，China)

Objective To establish a UPLC method for the determination of 7 kinds of ginseng saponins in the extract of total saponins ofPanaxginseng.The method was aimed to be more accurate and efficient for the quality evaluation of the extracts.Methods Ginsenoside Rg1,Re,Rf,Rb1,Rb2,Rc and Rd were separated by Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);the mobile phase was acetonitrile-water with a flow rate of 0.4 mL·min-1and the detection wavelength was 203 nm.Result The peaks were reached baseline separation.The separation factor was bigger than 1.5. There were good linear relationships of the 7 kinds of ginsenoside, and the RSD value was in line with the requirements.Conclusion UPLC can replace HPLC method for the determination of the contents of ginsenosides.The method is sensitive, simple, accurate and reproducible.

ginsenoside; general ginsenoside; UPLC

国家青年科学基金项目 (编号：81102768)

蔡艳，女，硕士，工程师

贾继明，男，博士，正高级工程师

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.001

R927.2

A

1004-2407(2016)05-0441-04

2016-03-16)