丹槐银屑浓缩丸对实验性银屑病模型豚鼠免疫调节的影响*

黄 萍陈少秀陈德森吴胜英彭吉霞（.湖北省十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 44000；.湖北医药学院，湖北 十堰 44000）

丹槐银屑浓缩丸对实验性银屑病模型豚鼠免疫调节的影响*

黄 萍1陈少秀1陈德森2△吴胜英2彭吉霞2
（1.湖北省十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院，湖北 十堰 442000）

目的 观察丹槐银屑浓缩丸对豚鼠实验性银屑病病理改变及免疫系统调节的影响，探讨其作用机制。方法 豚鼠40只，采用随机数字法随机分为模型组、维A酸组、丹槐低、中、高剂量组各8只，采用普萘洛尔溶液涂于豚鼠双耳背侧4周法造模，造模型成功后，维A酸组采用阳性药维A酸乳剂于皮损双耳涂药，丹槐低、中、高剂量组用丹槐银屑浓缩丸灌胃，模型组不处理。测定治疗前后豚鼠静脉血T淋巴细胞、红细胞、白细胞、单核细胞数量，测定血清总蛋白、血红蛋白、白蛋白含量，采用酶标双抗体夹心ELISA法测定肿瘤坏死因子（TNF-α）、干扰素（IFN-γ）、细胞因子白介素-1（IL-1）、IL-2、IL-6、IL-8等水平。结果 模型组静脉血T淋巴细胞、单核细胞、白细胞数量均有不同程度升高，血清总蛋白、白蛋白及血红蛋白无明显变化。维A酸组静脉血T淋巴细、单核细胞，白细胞数量明显降低，对体液免疫系统有抑制作用，豚鼠血清总蛋白、白蛋白及血红蛋白含量降低，与模型组比较差异有统计学意义（均P＜0.05）。丹槐中、高剂量组治疗后静脉血T淋巴细、单核细胞，白细胞数量明显降低，与本组治疗前及模型组比较差异有统计学意义（均P＜0.05），其血清总蛋白、白蛋白及血红蛋白有降低均势，但与治疗前比较差别不大（均P＞0.05），且丹槐中、高剂量组比较差别不大（均P＞0.05）。治疗前后模型组白介素TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均保持在较高水平，说明白介素炎性因子是引起动物皮肤发生银屑病样病理改变的基础。维A酸组白介素TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均明显降低，与本组治疗前及模型组比较差异有统计学意义（均P＜0.05）。丹槐中、高剂量组与维A酸组类似，其作用稍弱于维A酸，在治疗后TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均明显降低，与本组治疗前及模型组比较差异有统计学意义（均P＜0.05）。丹槐中、高剂量组比较差别不大（均P＞0.05）。模型组、维A酸组、丹槐低、中、高剂量组涂普萘洛尔的表皮均有类似于人类银屑病样改变，造模后出现明显的皮损等病理学特征，治疗前5组动物病理检查均有表皮角质层过度角化，棘层变厚、钉突延长，真皮层出现中重度炎细胞浸润，角质层血管炎、内有小脓肿等银屑病性改变。治疗后维A酸组皮损消失，表皮角化现象明显减少，几无炎细胞浸润、表皮钉突及小脓肿消退。丹槐中、高剂量组皮损面积降低，但病理检查仍有部分动物表皮有角化现象，角质层血管炎、小脓肿等银屑病性较模型组及治疗前明显好转。结论 丹槐银屑浓缩丸可在不影响体液免疫的情况下降低实验性银屑病豚鼠细胞免疫反应，抑制TNF-α诱导细胞因子与IFN-γ之间的级联反应，对白介素IL-1、IL-2、IL-6及IL-8等细胞因子介导的炎症反应亦有明显的抑制作用，可减轻炎症反应，具有与维A酸类似药理作用。

银屑病动物模型 丹槐银屑浓缩丸 细胞免疫 免疫调节

【Abstract】Objective：To observe the effect of dhyxnsw on regulation of guinea pig experimental psoriasis pathological changes and the immune system，to explore its mechanism of action.Methods：40 guinea pigs，were randomly divided into model group，A retinoic acid group，Dan Huai low，medium and high dose group.The propranolol solution was coated on the back side of the guinea pig ears for 4 weeks to model.And after successful modeling，A retinoic acid group with positive medicine a agent in lesions of binaural medicine，Dan Huai low，middle and high dose groups，with dhyxnsw gavage，compared model group without treatment.Before and after treatment，the venous blood T lymphocytes of guinea pig red blood cells，white blood cells，mononuclear cell number determination，determination of serum total protein，hemoglobin，albumin，tumor necrosis factor were determined by enzyme labeled by double antibody sandwich ELISA（TNF-α），interferon（IFN-γ），cytokine interleukin （IL-1），IL-2，-1 IL-6，IL-8 level.Results：dhyxnsw significantly decreased in the high dose group of Dan Huai，T lymphocytes，monocytes，TNF-α，IFN-γ，IL-1，IL-2，interleukin IL-6 and IL-8 secretion and synthesis also significantly inhibited，compared with the model group （P＜0.05），the difference was statistically significant，but Dan Huai in high dose group，the above indexes between two groups had no significant difference （P＞0.05）.Conclusion：dhyxnsw decreased cellular immunity in guinea pig psoriasis does not affect humoral immune reaction in the experimental conditions，the inhibition of TNF-α induced cascade reaction between cytokines and IFN-γ，also had an obvious inhibitory effect on the inflammatory reaction of interleukin IL-1，IL-2，IL-6 and IL-8 mediated by cytokines，reducing inflammation the reaction，with pharmacological action and similar A retinoic acid.

【Key words】dhyxnsw；psoriasis animal model；cell immunity；immune regulation

银屑病发病多系外邪化热入血造成机体过度反应，血热、血瘀、血燥病症并存乃现风热湿之象［1］，该病治疗有“治风先治血，血行风自灭”的观点。近年来中草药在临床治疗银屑病有突出表现，其中笔者所在医院应用具有清热解毒、凉血活血、祛风止痒之功效的丹槐银屑浓缩丸取得了较好疗效［2］。该药由丹参、槐花、柴草、赤芍、黄连、鸡血藤地黄、白鲜皮、高青叶等诸药调制成丸，其主要有效药理成份为有丹参素、黄连素、丹参酮、小檗碱等。目前对该丸药的系统研究较有限，且多局限于中医理论探讨，本实验以现代医学检验方法对其治疗银屑病进行了系统研究，以期探讨其对免疫调节的影响，为临床治疗银屑病提供实验依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 豚鼠40只，体质量（300±50）kg，实验动物由湖北医药学院实验动物中心提供，实验动物设施使用许可证SYXK（鄂）2011-0031，实验动物生产许可证SCXK（鄂）2011-0008。动物房温度22～26℃，湿度45%～75%，分笼饲养，自然光照，自由饮水，普通饲料喂养，每日观察动物进食情况，称体质量，及时清理粪便，本研究中动物处置方法符合动物伦理学标准［3］。

1.2 试药及仪器 丹槐银屑浓缩丸（黑龙江省中医研究院医院研制，规格1 g/丸，批号090801）；普萘洛尔片（江苏常州亚邦制药有限公司，批号040512）；阿维A胶囊（重庆华邦制药有限公司，10 mg，批号20010126）；兔VEGF共调节趋化因子1（VCC1）ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司提供，批号mi028457）。提取mRNA试剂及反转录试剂（美国Invitrogen公司提供）。

1.3 分组与造模 银屑病动物模型 40只豚鼠随机数字表编号分为模型组，维A酸组，丹槐低、中、高剂量组各8只。参照文献［4］，造模前将普萘洛尔片研碎配制成5%的水溶液备用，丹槐银屑浓缩丸研碎配制成10%的水溶液。造模时模型组，阿维A组，丹槐低、中、高剂量组5组动物双耳剃毛，用5%普萘洛尔水溶液均匀涂于双侧耳背，面积以11 cm，厚度1 mm为宜，每日1次，连续涂4周，以双耳涂药处出现银屑病样皮损为造模成功，空白对照组涂0.9%氯化钠注射液。本实验造模均出现银屑病样皮损，成功率100%。

1.4 给药方法 造模成功后，维A酸组按［1 mL/（kg·d）］用阳性药维A酸乳剂于皮损双耳涂药，丹槐低、中、高剂量组用丹槐银屑浓缩丸灌胃［低、中、高剂量按5、10、20 mL/（kg·d）］，4组动物均连续治疗4周，模型组不处理作为对照。治疗过程中观察动物皮损部位病理改变，结束后取病变组织做病理学检查，如表皮角质层是否角化，钉突及棘层病理改变情况。

1.5 标本采集与检测 参照文献［5］，于治疗前后分别经耳缘静脉取血测定治疗前后豚鼠静脉T淋巴细胞、血红细胞、白细胞，单核细胞数量，血清总蛋白、血红蛋白、白蛋白含量，采用酶标双抗体夹心ELISA法肿瘤坏死因子（TNF-α）、干扰素（IFN-γ）及白介素（IL）-1、IL-2、IL-6、IL-8等［6］。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件处理。计量资料实验数据均以（±s）表示，两组间的均数检验采用多因素方差分析，组间构成比差异检验采用χ2检验，相应的多因素分析分别采用双向方差CMH χ2检验。两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组免疫指标水平比较 见表1。模型组静脉血T淋巴细胞、单核细胞、白细胞数量均有不同程度升高，血清总蛋白、白蛋白及血红蛋白无明显变化。维A酸组静脉血T淋巴细、单核细胞，白细胞数量明显降低，对体液免疫系统有抑制作用，豚鼠血清总蛋白、白蛋白及血红蛋白含量降低，与模型组比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）。丹槐中、高剂量组治疗后静脉血T淋巴细、单核细胞，白细胞数量明显降低，与本组治疗前及模型组比较，差异有统计学意义（均P＜0.05），其血清总蛋白、白蛋白及血红蛋白有降低均势，但与治疗前比较差别不大（均P＞0.05），且丹槐中、高剂量组比较差别不大（均P＞0.05），说明丹槐银屑浓缩丸对体液免疫系统无抑制作用。

表1 各组免疫指标水平比较（±s）

表1 各组免疫指标水平比较（±s）

与本组治疗前比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

血红蛋白（g/100 mL）11.39±2.87 14.64±7.32 12.24±2.13 15.52±6.39 12.66±2.70 14.91±2.25 （n=8） 治疗后8.59±0.84 9.94±2.12*△1.75±0.30*△43.76±5.67*△10.21±2.20*△9.27±2.24*△10.21±3.29*△丹槐低剂量组治疗前8.54±0.74 12.27±2.16 2.57±0.25 75.37±6.49 15.54±2.98 12.73±2.20 15.54±1.98 （n=8） 治疗后8.83±0.85 11.20±2.32 2.30±0.26 71.37±6.01 14.74±2.18 11.27±1.96 15.74±2.18丹槐中剂量组治疗前8.56±0.79 12.27±2.21 2.27±0.27 77.24±6.49 15.54±1.98 12.73±2.20 15.54±1.98 （n=8） 治疗后8.83±0.85 9.20±2.19*△1.60±0.22*△53.30±5.06*△14.79±2.32 10.45±1.74 13.74±2.59丹槐高剂量组治疗前8.39±0.71 12.15±2.24 2.39±0.23 72.27±4.26 16.22±3.42 11.50±2.59 15.22±3.12 （n=8） 治疗后8.41±0.87 9.36±2.09*△1.54±0.31*△49.79±5.35*△14.97±3.93 10.27±3.45 14.63±3.97组别 时间 红细胞（个/μL）白细胞（个/μL）白蛋白（g/100 mL）模型组 治疗前（n=8） 治疗后维A酸组 治疗前单核细胞（%）8.28±0.74 12.21±2.17 2.32±0.22 8.93±0.77 16.20±2.54*4.30±0.24*8.37±0.83 12.32±3.33 2.59±0.31 T淋巴细胞（%）70.10±5.65 78.37±6.87*69.59±5.98总蛋白（g/100 mL）15.64±2.36 16.52±2.31 14.91±2.17

2.2 各组TNF-α、IFN-γ及白介素比较 见表2。治疗前后模型组TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均保持在较高水平，说明白介素炎性因子是引起动物皮肤发生银屑病样病理改变的基础。维A酸组TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均明显降低，与本组治疗前及模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。丹槐中、高剂量组与维A酸组类似，其作用稍弱于维A酸，在治疗后TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均明显降低，与本组治疗前及模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。丹槐中、高剂量组比较差别不大（P＞0.05）。

表2 各组TNF-α、IFN-γ及白介素水平比较（±s）

表2 各组TNF-α、IFN-γ及白介素水平比较（±s）

IL-8β （pg/mL）81.39±9.80 83.27±8.24 82.20±9.02 （n=8） 治疗后 18.±1.82*△14.9±2.32*△30.7±4.30*△53.7±5.02*△43.2±4.29*△61.2±7.22*△丹槐低剂量组 治疗前 42.70±5.21 33.21±4.804 62.79±7.55 76.10±7.62 66.01±7.37 80.73±8.78 （n=8） 治疗后 38.80±4.81 29.22±3.30 55.30±6.22 71.87±7.68 64.74±7.12 79.27±8.21丹槐中剂量组 治疗前 41.52±5.79 32.27±2.21 63.27±0.27 77.20±7.40 65.54±1.98 82.73±2.20 （n=8） 治疗后 29.81±2.82*△22.20±2.97*△40.60±4.27*△55.30±6.14*△44.79±5.30*△67.27±7.54*△丹槐高剂量组 治疗前 43.31±5.76 32.15±3.27 62.32±7.29 75.20±8.20 66.29±7.47 81.51±9.55 （n=8） 治疗后 28.49±2.96*△21.36±2.74*△39.54±3.90*△56.79±6.02*△45.39±5.75*△66.27±7.02*△组别 时间IL-1β （pg/mL）43.28±5.74 32.21±4.19 62.72±7.29 45.34±5.87 33.25±4.19 64.35±7.24 44.78±5.85 34.21±4.84 62.79±7.52 TNF-α （ng/mL）IFN-γ （μg/mL）模型组 治疗前（n=8） 治疗后维A酸组 治疗前IL-2β （pg/mL）77.17±7.64 75.37±7.80 76.10±7.67 IL-6β （pg/mL）65.60±7.32 67.52±7.39 66.65±7.37

2.3 病理改变观察 模型组、维A酸组、丹槐低、中、高剂量组涂普萘洛尔的表皮均有类似于人类银屑病样改变，造模后出现明显的皮损等病理学特征，治疗前5组动物病理检查均有表皮角质层过度角化，棘层变厚、钉突延长，真皮层出现中重度炎细胞浸润，角质层血管炎、内有小脓肿等银屑病性改变。治疗后维A酸组皮损消失，表皮角化现象明显减少，几无炎细胞浸润、表皮钉突及小脓肿消退。丹槐中、高剂量组皮损面积降低，但病理检查仍有部分动物表皮有角化现象，角质层血管炎、小脓肿等银屑病性较模型组及治疗前明显好转。

3 讨 论

银屑病俗称“牛皮癣”，是一具有泛发性、易复发性、顽固性特点的表皮细胞增殖过快及角化不全慢性炎症性皮肤病。银屑病的病理基础与链球菌感染、遗传、自身免疫异常相关，发病多与T淋巴细胞过度增殖、炎症因子介导的炎症反应、内分泌失调、精神、神经因素等均有关［7］。最新研究表明自身免疫异常是其主要诱因，T淋巴细胞可驱动皮损表皮病理改变，其过度增殖及细胞因子介导的炎症反应常用引起皮乳头微血管的异常增生，表皮细胞增殖过快和角化不全、毛细血管扩张均可加重银屑病皮损及病理进程［8］。近年来研究发现通过免疫调节，抑制过度免疫反应有明显疗效的治疗作用。

目前多数学者认为TNF-α由由皮损部位表皮细胞产生，如角质形成细胞、T细胞、中性粒细胞、单核细胞等［9］。TNF-α能诱导细胞因子如白介素和IFN-γ产生级联反应，TNF-α直接或间接通过细胞因子白介素产生IFN-γ，而IFN-γ在银屑病的发生发展中起到至关重要的介导作用［10］。白介素全称白细胞介素，分析15种亚型，如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12等，是白细胞或免疫细胞间相互作用的细胞因子在传递信息激活与调节免疫细胞介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用，是重要的炎症介质。IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等是机体重要炎症介质，可在机体感染及其他无菌性炎症反应时诱导激活T、B淋巴细胞分化，增加中性粒细胞溶酶体酶的活性及T、B淋巴细胞、单核巨噬细胞的吞噬功能。银屑病的发病机制目前尝无定论，多数学者更倾向于银屑病是由T淋巴细胞介导，T淋巴细胞的异常增殖常导致红斑鳞屑性皮肤病［11］，刺激真皮乳头微血管的异常增生进而加重银屑病发生发展，导致严重皮损。亦有学者银屑病是由自分泌型血管内皮生长因子增多造成，血管内皮生长因子是一种高度特异性的促血管生长因子，银屑病患者血管内皮生长因子及其受体HIT-l、KDR均出现过度表达［12］。

在治疗4周后，与模型组比较，丹槐中、高剂量组T淋巴细胞、单核细胞数、TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均明显降低，提示丹槐银屑浓缩丸可能通过抑制TNF-α诱导细胞因子与IFN-γ之间的级联反应，降低T淋巴细胞分化，下调IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等，干预炎症细胞及单核巨噬细胞过多进入表皮及真皮以下组织，阻断IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等介导激活单核巨噬细胞活化及炎性浸润，避免表皮由于炎症反应出现皮损。观察发现，模型组静脉血T淋巴细胞、单核细胞、白细胞数量及白介素TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均保持在高水平，这说明细胞免疫系统T淋巴细胞及细胞因子与银屑病确有明确的相关性。阳性药维A酸为抗皮肤角化异常药，其药理作用主要是抑制T细胞增殖及表皮I型转谷氨酰胺酶、促进角质形成细胞分化，同时也有抑制角质形成细胞增殖、抑制白细胞趋化性，具有调节表皮细胞分化和增殖等作用［13］。维A酸组治疗后异常增殖T淋巴细胞明显降低，佐证阿维A确有抑制T细胞增殖的作用。丹槐中、高剂量组治疗后作用与维A酸组类似，其静脉血T淋巴细胞、单核细胞、白细胞数量及TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等均明显降低。在本方中，君药紫草味苦性寒，可凉血清热；臣药黄连、白鲜皮、高青叶可清热解毒，尤其黄连的有效成份黄连素、小檗碱具有确切的清热解毒、抗炎清肿之功效［14-15］；鸡血藤及丹参佐药皆为上等活血良药，《吴普本草》记载丹参味辛性凉，其有效成份丹参酮、丹参素具有活血化瘀，松弛血管平滑肌改善微循环的作用［16］。白茅根凉血生津清热利水，泽泻甘寒泄热毒，以上君臣诸药可疏通肤络、清泄热毒、清热解毒、凉血活血而达到祛屑止痒之目的。从实验结果来看，丹槐银屑浓缩丸可在不影响体液免疫的情况下降低实验性银屑病豚鼠细胞免疫反应，抑制TNF-α诱导细胞因子与IFN-r之间的级联反应，对白介素IL-1、IL-2、IL-6及IL-8等细胞因子介导的炎症反应亦有明显的抑制作用，可减轻炎症反应，具有与维A酸类似的免疫调节药理作用。

［1］ 樊敏，宋宪.低剂量维A酸联合消银肤乐饮治疗银屑病150例［J］.中国中西医结合杂志，2003，23（10）：784-785.

［2］ 王学军，陶以成，刘长发，等.丹槐银屑浓缩丸对低鼠银屑病模型的病理实验研究［J］.中国中医急症，2010，19（1）：104-106.

［3］ 张建红，刘田福，武东梅，等.生物医学研究中的实验动物福利问题［J］.中国实验动物学杂志，2001，11（1）：62-64.

［4］ 王学军，胡二为，陶以成，等.丹槐银屑浓缩丸对豚鼠银屑病样模型组织VEGF、VEGFR含量的影响［J］.中国中西医结合皮肤性病学杂志，2011，10（2）：96-97.

［5］ 李瑾，顾军，毕新岭，等.维A酸对银屑病患者外周血T淋巴细胞增殖及JAK3表达的影响［J］.中国皮肤性病学杂志，2007，21（11）：641-643.

［6］ Wang Z，Qiu Y，Lu Ji，et al.Connective tissue growth factor promotes interleukin-1β-mediated synovial inflammation in knee osteoarthritis［J］.Mol Med Rep，2013：8（3）：877-882.

［7］ 赵辩.临床皮肤病学［M］.3版.江苏：科学技术出版社，2001：759-762.

［8］ Lowe PM，Lee ML，Jackson CJ，et al.The endothelium in posriasis［J］.Br J Dermato1，1995，132：497-505.

［9］ Bos JD，de Rie MA，Teunissen MB，et al.Psoriasis：dysregulation of innate immunity［J］.Br J Dermatol，2005，152：1098-1107.

［10］郑敏.银屑病是细胞免疫介导性疾病［J］.中华皮肤科杂志，2002，35（2）：85-87.

［11］李瑾，顾军，毕新岭，等.维A酸对银屑病患者外周血T淋巴细胞增殖及JAK3表达的影响［J］.中国皮肤性病学杂志，2007，21（11）：641-643.

［12］朱凡，郑敏，鲍彰，等.银屑病患者皮损中血管内皮生长因子受体的表达与血管增生的关系［J］.中华皮肤科杂志，2003，36（7）：365-367.

［13］王学军，贾丽梅.丹槐银屑浓缩丸治疗寻常型银屑病264例临床观察［J］.中国中医药科技，2008，15（6）：474-476.

［14］肖云，游顶云，余晓玲，等.盐酸黄连素油对激素依赖性皮炎皮肤屏障功能的修复作用［J］.皮肤病与性病，2015，37 （1）：53-55.

［15］尚文斌，刘佳，于希忠，等.低檗碱对肥胖低鼠炎症因子分泌和炎症信号通路的作用［J］.中国中药杂志，2010，11（11）：1474-1477.

［16］周松，陈腾，王青丽，等.丹红注射液的药理作用与临床应用概述［J］.中国药师，2008，11（8）：987-989.

Effect of Dhyxnsw Regulation on Experimental Psoriasis Model of Guinea Pig Immunity

HUANG Ping，CHEN Shaoxiu，CHEN Desen，et al.Shiyan Taihe Hospital affiliated to Hubei Medical College，Hubei，Shiyan 442000，China

R285.5 文献标志码：A

1004-745X（2016）08-1508-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.015

湖北省教育厅重点项目（D20092404）

（电子邮箱：yanzhenqiangyzq@163.com）

2016-03-05）