腧穴针刺对急性期偏头痛大鼠中脑组织SP及其受体NK-1的影响*

唐美霞 王 茜 耿俊隆 杜若桑 郑淑美崔 海（首都医科大学，北京 100069）

·研究报告·

腧穴针刺对急性期偏头痛大鼠中脑组织SP及其受体NK-1的影响*

唐美霞 王 茜 耿俊隆 杜若桑 郑淑美△崔 海△
（首都医科大学，北京 100069）

目的 观察腧穴针刺对偏头痛大鼠中脑P物质（SP）及其受体NK-1 mRNA表达的影响，为探讨针刺治疗急性偏头痛机制提供依据。方法 40只健康Wistar雄性大鼠按随机数字表法分为空白对照组（A组）、模型对照组（B组）、腧穴电针组（C组）、伪电针组（D组）4组，每组10只。各组按设计方案进行造模，和针刺预防治疗后，断头取中脑，应用实时定量PCR技术，测定各组大鼠中脑P物质及其受体NK-1 mRNA的表达量。结果 与A组比较，B、C、D组SP mRNA、NK-1 mRNA表达量明显增高（P＜0.05）。与B组比较，C、D组SP mRNA、NK-1 mRNA表达量明显降低（P＜0.05）。与D组比较，C组SP mRNA、NK-1 mRNA表达量明显降低（P＜0.05）。结论 针刺能通过下调急性期偏头痛大鼠中脑SP及NK-1基因表达水平，发挥预防治疗偏头痛的作用，且腧穴针刺疗效更佳。

偏头痛 针刺 P物质 NK-1

【Abstract】Objective：To observe the effect of electroacupuncture on the expression of substance P（SP）and its receptor Neurokinin-1 mRNA in the Mesencephalon in rats with migraine.Methods：40 adult male Wistar rats were equally randomized into 4 groups：the blank group（group A），the model （group B），acupoints electroacupuncture（group C），and non-acupoints electroacupuncture（group D），10 in each group.After modeling and electroacupunture treatment，all rats were decapitated，and Mesencephalon was removed and SP and receptor Neurokinin-1（NK-1）mRNA expression were detected by real-time quantitative PCR.Results：Compared with A group，the expression of SP mRNA and NK-1 mRNA rose obviously in the other three groups（P＜0.05）.Compared with B group，the expression of SP mRNA and NK-1 mRNA dropped obviously in group C and D （P＜0.05）.Compared with D group，the expression of SP mRNA and NK-1 mRNA of group C dropped obviously（P＜0.05）.Conclusion：Acupoints electroacupuncture can efficiently prevent and treat migraine headache by downregulating gene expression level of SP and NK-1 mRNA，and acupoints electroacupuncture has a better effect.

【Key words】Migraine；Acupuncture；Substance P；NK-1

偏头痛多为一侧或两侧颞部反复发作的搏动性头痛，发作前可伴视觉、体觉先兆，发作时常伴呕吐［1］，其发病率一直居高不下，且有逐年增高的趋势。目前，世界卫生组织已经将偏头痛列为致残疾病第19位［2］。近年大量针灸治疗偏头痛的临床疗效观察表明针刺治疗偏头痛的治疗效果显著，且成本低、安全可靠［3-6］；但针灸治疗偏头痛作用机理尚未明确［7-8］。随着深入研究，发现多种神经肽与偏头痛的发作有关［9-13］，其中包括SP、降钙素相关肽（CGRP）、神经肽Y、神经肽M等等，越来越多地引起人们的关注，而SP与疼痛密切相关［9，12］。NK-1受体作为SP结合最为紧密的受体，与SP一起作为神经递质在偏头痛过程中的作用越来越受重视［14］。本研究以P物质及其受体NK-1为研究点，通过对硝酸甘油偏头痛大鼠模型［15］应用实时定量 PCR （PCR）技术，定量检测针刺对偏头痛大鼠中脑SP及其受体NK-1mRNA表达的变化，在基因水平上探讨针刺对偏头痛的治疗作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD雄性大鼠40只，体质量（250±50）g，购于首都医科大学实验动物部。每4只一个笼子，清洁级实验室喂养，自由摄食、饮水。饲养温度（22±1）℃，湿度40%～70%，噪音＜60分贝，换气次数10～20次/min，光照时间每天12 h（8∶00～20∶00），光照时间模拟昼夜交替；适应性饲养7 d。

1.2 主要试剂、仪器 硝酸甘油注射液由北京益民药业有限公司生产（批号20150702，1 mL：5 mg），0.9%氯化钠注射液由江西中牧实业股份有限公司生产 （批号1504047，20 mL），SYBR FAST qPCR Kit Master Mix （2×）Universal（美国KAPA Biosystems）。高速冷冻离心机，由Beckman公司生产 （型号Beckman Allgre 21 R）；凝胶成像仪，由上海山富科学仪器有限公司生产（型号BioSens SC 810 B）；分光光度计，由ACTGene公司生产（型号NAS-99）；实时定量PCR仪，由linegene（bioer公司生产（型号TCP0096）；一次性无菌针，由中国苏州医疗用品厂有限公司生产 （批号2140080，0.25×13 mm）。电针用华佗牌电针仪，由中国苏州医疗用品厂有限公司生产（型号G-6805-2）。

1.3 分组与造模 40只Wistar雄性大鼠按随机数字表法分为4组，空白对照组 （A组），模型对照组（B组），腧穴电针组（C组），伪电针组（D组），每组10只。参照文献［16］中偏头痛大鼠模型备制方法，采用背部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg，复制其模型。观察急性偏头痛大鼠造模后30～60 min的行为学症状并记录，以出现往返运动、挠头、爬笼、咬尾次数增多，以及双耳发红症状为偏头痛模型造模成功。

1.4 针刺穴位选择 腧穴电针组根据针灸临床治疗偏头痛经验穴［17-19］，同时参照华兴邦等制定的《实验动物穴位图谱》，取双侧太阳、风池、单侧太冲、足临泣进行针刺治疗；伪电针组选择非经非穴点，本研究沿用杨旭光等［20］临床研究选择非穴位点，选择4个非经非穴位点进行针刺治疗，非穴位点1）臂内前缘三角肌与肱二头肌交界处；非穴位点2）肱骨内上髁与尺骨腕部的中点，尺侧缘；非穴位点3）足三里水平旁开非穴位点，胫骨外侧缘处；非穴位点4）肘内侧，肘尖与腋窝连线中点。常规消毒，直刺0.25～0.30 mm，将G-6805-2型电针仪。疏波，频率2～5次/s，强度0.1～0.2 mA，留针20 min，每日上午针灸1次。

1.5 干预方法 A组正常饲养7 d，不进行任何处理，第8日皮下注射0.9%氯化钠注射液2 mL/kg。B组正常饲养7 d，不进行任何处理，第8天皮下注射硝酸甘油10 mg/kg造模。C组腧穴电针治疗7 d，20 min/d，第8日皮下注射硝酸甘油10 mg/kg造模。D组非腧穴电针治疗7 d，20 min/d，第8日皮下注射硝酸甘油10 mg/kg造模。造模成功后，A、B组不进行任何处理；C组给予20 min腧穴电针1次；D组给予20 min非腧穴电针1次。

1.6 标本采集及指标检测 治疗结束后，在2～4 h内，水合氯醛麻醉大鼠，断头取脑，快速剥离大脑，取中脑组织，50～100 g置于液氮中，立即保存于-70℃冰箱中备用。检验中脑组织SP及NK-1 mRNA表达。1）样本总RNA提取：取中脑组织25～30 mg，分别加入300 μL裂解液RL，按试剂说明书操作步骤进行总RNA提取。使用紫外光分光光度计检测样本RNA的纯度与浓度；样本RNA在260 nm和280 nm处波长下的吸光度，读取A260/A280比值，来检测样本RNA纯度，要求其比值范围在1.8～2.2之间；并计算RNA浓度为A260×40（ng/μL）。取8 μL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳。2）cDNA：用HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，实验操作按产品说明书进行。反应体系20 μL。放入eppendorf梯度PCR仪中，65℃5 min，37℃40 min，70℃10 min进行反转录。得到的cDNA放置在-70℃冰箱保存备用。3）SYBR GreenⅠ实时定量PCR：检索SP、NK-1特异性引物，使用ncbi-primer对引物进行设计与调试，引物合成。目的基因引物序列（5′to 3′）如下：SPF为CTGGTCCGACAG TGACCAAA，SPR为TCTGCATTGCGCTTCTTTC，扩增产物大小为227 bp；NK-1 RF为GGCCTTTCCACAAGGC TACT，NK-1 RR为TGTACGCGTAGCCGATCAC，扩增产物大小为167 bp；Beta-actinF为CCCATCTATGAGG GTTACGC，Beta-actinR为TTTAATGTCACGCACGATT TC，扩增产物大小为150 bp。20 μL反应体系，其中包括SYBR Master Mix（2×）Universal 10 μL，Primer F （10 μm）1.5 μL，Primer R（10 μm）1.5 μL，模板3 μL，ROX校正染料0.5 μL，ddH2O 3.5 μL补齐至20 μL。以上各样本均做3个复孔。用PCR仪进行扩增，扩增条件为：95℃10 min，（95℃10 s，59℃60 s）×45个循环。在扩增条件中加入溶解曲线分析，分析模式为：95℃15 s，72℃15 s，95℃15 s。再采用2-△△ct方法进行数据的相对定量分析。

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件处理。计量资料以 （±s）表示，组间均数比较采用One-way ANOVA进行分析。计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

各组大鼠中脑组织中SP mRNA、NK-1 mRNA表达比较 见表1。与A组比较，B、C、D组SP mRNA、NK-1 mRNA表达量明显增高（P＜0.05）。与B组比较，C、D组SP mRNA、NK-1 mRNA表达量明显降低 （P＜0.05）。与D组比较，C组SP mRNA、NK-1 mRNA表达量明显降低（P＜0.05）。

3 讨 论

针刺是中医学经过几千年沉淀的经验精华之一。

表1 各组大鼠中脑组织中SP mRNA表达比较（±s）

表1 各组大鼠中脑组织中SP mRNA表达比较（±s）

与A组比较，△P＜0.05；与B组比较，◆P＜0.05；与D组比较，﹟P＜0.05。

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近年许多研究者对其进行研究，尤在镇痛方面的研究颇多，且取得了一定的成就。本研究根据临床经验选取了双侧太阳、风池［21］，单侧太冲、足临泣；以少阳经［22］为主，远近配穴［16］更有效的治疗偏头痛。电针选择疏波，不断地刺激腧穴可改善血流，舒张血管，缓解疼痛，减少发作频率。已有研究证明电针影响痛觉传递，以及神经肽的释放，从而对偏头痛有积极预防治疗作用［23］。本研究中，通过行为学观察，C组往返运动、挠头、爬笼、咬尾症状较B、D组明显缓解，且D组较B组的行为学症状明显缓解；通过RT-PCR方法，检测到C组大鼠中脑SP、NK-1 mRNA表达量均明显降低，说明电针可以下调急性期偏头痛大鼠中脑SP、NK-1的基因表达，达到预防治疗作用；同时也证明C组相较D组疗效更佳。

SP作为一级伤害性传入纤维末梢释放的神经递质，对痛觉的传递也起着重要作用［24］。SP主要分布在脑内，其中中脑含量最高，尤其中脑导水管周围灰质区（PAG）［25-26］。SP被作为是一种神经递质与神经调节，可通过多种受体 （主要是NK-1受体）参与第二信使偶联。当神经受刺激后，SP与NK-1受体结合发挥生理作用，参与痛觉传递［27］。目前研究认为SP既可以传递痛觉信息、参与信号传导，又有产生疼痛的作用，与痛觉关系密切［28］。

本研究通过RT-PCR，对各组大鼠中脑SP、NK-1 mRNA进行定量分析，结果发现与A组比较，B、C、D 组SP mRNA、NK-1 mRNA表达量明显增高。与B组比较，C、D组SP mRNA、NK-1 mRNA表达量明显降低。与D组比较，C组SP mRNA、NK-1 mRNA表达量明显降低。提示偏头痛大鼠中脑SP、NK-1表达量增加；以上提示SP及NK-1与偏头痛的发作密切相关。

本研究结果示，腧穴针刺治疗急性期偏头痛疗效确切，并能缓解急性期症状。因此，笔者推断急性偏头痛的发生与SP及其受体NK-1的释放量有关，SP通过受体NK-1传导痛觉，产生致痛作用，促使急性期偏头痛的发生。针刺可下调SP、NK-1基因表达水平，发挥防治偏头痛的作用。

［1］ 闻路琼.针刺治疗偏头痛急性期临床疗效评价［J］.中国社区医师，2015，29（14）：98-99.

［2］ Thornton E，Vink R.Substance P and its tachykinin NK-1 receptor：a novel neuroprotective target for Parkinson′s disease［J］.Neural Regen Res，2015，10（9）：1403-1405.

［3］ 张银开.针刺治疗偏头痛66例疗效观察［J］.上海中医药杂志，2012，38（3）：61.

［4］ 郭伟，饶华金.针刺治疗偏头痛疗效观察［J］.上海针灸杂志，2011，30（5）：289-290.

［5］ 梁日楚.针刺治疗偏头痛临床疗效观察［J］.中国医药导刊，2011，13（5）：775-776.

［6］ 孙赫楠.针刺治疗偏头痛84例疗效观察［J］.中国卫生标准管理，2014，5（9）：54-55.

［7］ 江建忠，王倩，顾沿泊，等.国内外偏头痛2004-2013年研究热点分析［J］.脑与神经疾病杂志，2015，23（2）：121-126.

［8］ 赵维民，张波.偏头痛发病机制的研究进展［J］.中医药临床杂志，2015，27（1）：125-127.

［9］ 赵国敏，尹金淑.P物质及其受体神经激肽1受体与疼痛的相关性研究［J］.医学综述，2015，22（16）：2890-2893.

［10］申崇标，曾照芳.降钙素基因相关肽与偏头痛关系的研究［J］.生物信息学，2010，8（1）：57-59.

［11］Fusayasu E，Kowa H，Takeshima T，et al.Increased plasma substance P and CGRP levels，and high ACE activity in migraineurs during headache-free periods［J］.PAIN，2007，128 （3）：209-214.

［12］Schmidt MJ，Roth J，Ondreka N，et al.A potential role for substance P and interleukin-6 in the cerebrospinal fluid of cavalier king charles spaniels with neuropathic pain［J］.J Vet Intern Med，2013，27（3）：530-535.

［13］Hirsch S，Birklein F.Pain-relieving effect of CGRP antagonism on inflammatory pain［J］.Schmerz，2014，28（5）：532-535.

［14］May A，Goadsby PJ.Substance P receptor antagonists in the therapy of migraine［J］.Expert Opin Investig Drugs，2001，10 （4）：673-678.

［15］姜磊，于生元，董钊.实验性偏头痛动物模型研究现状［J］.中国比较医学杂志，2008，18（8）：62-64.

［16］孟宪慧，张治国，向丽华.远近配穴法针刺对偏头痛模型大鼠血浆CGRP及ET-1的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2014，20（5）：664-665.

［17］闫明，张贝贝，任璐璐，等.针刺治疗偏头痛选穴的临床研究概述［J］.河南中医，2015，40（5）：1149-1151.

［18］冯菲菲.针灸治疗偏头痛选穴组方规律的文献研究［D］.广州：广州中医药大学，2013.

［19］高玉杰.针刺少阳经特定穴对偏头痛患者脑功能动态影响的研究［D］.成都：成都中医药大学，2012.

［20］杨旭光.循经取穴针刺治疗偏头痛的临床随机对照研究［D］.成都：成都中医药大学，2009.

［21］刘波.针刺“头四关穴”治疗偏头痛的临床与实验研究［D］.哈尔滨：黑龙江中医药大学，2004.

［22］陈勤.少阳经穴针刺治疗偏头痛的代谢组学研究［D］.成都：成都中医药大学，2009.

［23］任旭，牛争平.降钙素基因相关肽在偏头痛发病机制中的研究进展［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2004，2（4）：229-231.

［24］姜波，李清美，于素清，等.女性偏头痛患者血浆中β-内啡肽和P物质含量的定量分析［J］.中华神经科杂志，1999，45 （1）：59-60.

［25］Harrison S，Geppetti P.Substance p［J］.Int J Biochem Cell Biol，2001，33（6）：555-576.

［26］黄卫，李海标，卢光启.P物质在大鼠脑室管膜中定位分布的免疫组织化学研究［J］.解剖学报，1996，44（2）：158-160.

［27］郑淑美，陈玉静，崔海.基于大鼠中脑SP及其受体变化探讨针刺治疗偏头痛作用机制［J］.世界中医药，2014，9（7）：961-964.

［28］石宏，景向红，邱恩超，等.电针对偏头痛大鼠的皮层扩展性抑制以及体内神经肽含量的影响［C］.中国针炙学会经络分会第十届学术会议，2009：209-212.

Effects of Acupoint Electroacupuncture on Mesencephalon Substance P and Its Receptor Neurokinin-1 in Rats with Acute Migraine

TANG Meixia，WANG Qian，GENG Junlong，et al.Capital Medical University，Beijing 100069，China.

·研究报告·

R246 文献标志码：A

1004-745X（2016）08-1474-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.006

首都中医药研究专项（15ZY21）

（电子邮箱：13142104158@163.com）

2016-04-28）