Dectin-1受体、白细胞介素-17及白细胞介素-12在小鼠巨噬细胞活化后真菌性角膜炎中的表达

董骋寰， 郑晓倩， 徐国兴



Dectin-1受体、白细胞介素-17及白细胞介素-12在小鼠巨噬细胞活化后真菌性角膜炎中的表达

董骋寰， 郑晓倩， 徐国兴

目的检测小鼠活化巨噬细胞真菌性角膜炎中的人树突状细胞源性C型凝集素样受体-1(Dectin-1)受体、白细胞介素-17(IL-17)及白细胞介素-12(IL-12)的表达水平。方法分别向小鼠角膜创口内注入乳胶微粒液或PBS液构成实验组与对照组。于感染后第1,3,5,7,9 d，裂隙灯显微镜下观测各组小鼠真菌性角膜炎特点，H-E染色观测其病理特征；通过Realtime-PCR检测小鼠角膜中Dectin-1受体、IL-17及IL-12基因mRNA的表达。结果(1)实验组角膜浸润混浊，于第7天多发穿孔，未发现新生血管；对照组角膜混浊，于第5天广泛分布新生血管，未发现穿孔。(2)实验组角膜大量炎症细胞汇集，第5天基质细胞排列紊乱，破坏严重。(3)Realtime-PCR结果表明感染后第3,5,7,9 d，实验组Dectin-1受体、IL-17、IL-12基因mRNA的表达量显著高于对照组(P<0.05)。结论Dectin-1受体、Th1及Th17细胞免疫可能在角膜抵御真菌感染的机制中发挥重要作用。

角膜炎； 眼感染，真菌性； 巨噬细胞； 凝集素类； Th1细胞/免疫学； T淋巴细胞； 白细胞介素类

真菌性角膜炎是一种影响广泛、易导致失明的眼表疾病。正常角膜中不存在巨噬细胞。当感染真菌时，巨噬细胞上的人树突状细胞源性C型凝集素样受体-1(Dectin-1)受体通过识别真菌表面的β-(1,3)-葡聚糖，激活巨噬细胞向病变组织浸润聚集并驱动Th1及Th17细胞应答。Dectin-1受体、Th1及Th17细胞应答参与机体清除真菌感染，但在真菌性角膜炎中的机制尚不明确。

本研究通过模拟小鼠巨噬细胞活化后真菌性角膜炎，观测小鼠真菌性角膜炎的临床、病理特征及各阶段Dectin-1受体、白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)及白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)的表达情况，研究Dectin-1受体、IL-17、IL-12在真菌性角膜炎中发挥的作用。

1　材料与方法

1.1动物5～6周已排除全身疾病的清洁级Balb/c小鼠100只[许可证编号：SCXK(沪)2007-0005]，体质量19～20 g，不限雌雄，随机分为实验组和对照组各50只；30只已排除全身疾病的Sprague-Dawley(SD)大鼠(角膜植片用)[许可证编号：SCXK(沪)2007-0005]，体质量200～250 g。

1.2方法

1.2.1菌株标准茄病镰刀菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号：3.2889)，28 ℃于下Sabouroud培养基内培育7 d后，采用无菌PBS液稀释菌液至浓度1×106CFU/mL。

1.2.2建立活化巨噬细胞后真菌性角膜炎模型眼科常规消毒麻醉后，于小鼠角膜表面刮出长约1 mm、深达浅基质层的创口。实验组向创口内注入乳胶微粒液8 μL，对照组注入PBS液8 μL，其余步骤与实验组一致。继续饲养1周后，依据表层镜法，用圆刀片刮除各组角膜上皮(直径约1.5 mm)，覆盖直径约2 mm大鼠角膜植片，植片与角膜层间注入10 μL真菌液，缝合睑缘，再注入真菌液5 μL，术后结膜囊涂氧氟沙星眼膏预防其他感染，于24 h后拆除植片[1]。

1.2.3真菌性角膜炎模型的鉴定小鼠缝线拆除后，模型成活100只，随机抽取实验组小鼠，刮取溃疡病灶，行真菌培养并鉴定菌种，同时排除细菌性角膜炎。

1.2.4角膜炎形态观察病原感染后第1,3,5,7,9 d，裂隙灯显微镜下观测各组角膜炎的面积大小、密度、表面的规则度，参考HU的评分标准进行临床评分，3个指标的所得分数相加即为总分。正常的角膜记0分，角膜轻度感染记1～4分，角膜中度感染记5～8分，角膜重度感染记9～12分[1]。

1.2.5实验室检测于感染后第1,3,5,7,9天，角膜组织切片行H-E染色组织病理学检测、免疫组织化学检测F4/80细胞(巨噬细胞)、Realtime-PCR检测Dectin-1受体、IL-17、IL-12基因mRNA的表达，PCR引物序列及扩增产物大小见表1。

表1　小鼠PCR引物序列及扩增产物的长度

Dectin-1受体:人树突状细胞源性C型凝集素样受体-1； IL-17：白细胞介素-17； IL-12：白细胞介素-12.

1.3统计学处理采用SPSS 17.0软件分析数据，组内及组间的比较采用重复测量方差分析，P<0.05为差别具有统计学意义。

2　结　果

2.1真菌性角膜炎形态观察及炎症评分感染后第1天实验组角膜中央轻度水肿；第3天角膜轻度隆起水肿伴雾状混浊；第5天角膜明显苔藓样混浊，直径约1 mm，角膜表面凹凸不平，周围伴有混浊环形浸润；第7天角膜中央溃疡、明显有水肿，伴坏死病灶或穿孔；第9天浸润混浊多发穿孔，未见新生血管。对照组第1天角膜轻度水肿，第3及5天角膜白色混浊；第7及9天角膜中央轻度水肿伴灰白色混浊，新生血管广泛分布，角膜未出现坏死穿孔，各组巨噬细胞活化后小鼠真菌性角膜炎症评分见表2。

表2　巨噬细胞活化后小鼠真菌性角膜炎实验组和对照组临床评分

2.2活化的巨噬细胞分布小鼠F4/80细胞是小鼠单核巨噬细胞的特异性单克隆抗体，若小鼠角膜上无单核巨噬细胞分布，则角膜无阳性F4/80细胞。小鼠真菌性角膜炎感染后各时间点角膜及前房可见大量阳性F4/80细胞分布。

2.3H-E染色结果感染后实验组第1,3,5天角膜及前房大量炎症细胞汇集，第5天后伴发角膜基质纤维排列紊乱；对照组第1,3,5天小鼠角膜炎症细胞浸润，第5,7天炎症细胞减轻，新生基质纤维细胞生长见图1。

2.4小鼠角膜中Dectin-1受体及IL-17、IL-12基因mRNA检测结果感染后第3,5,7天实验组IL-17、IL-12、Dectin-1受体表达量不断上调，且实验组显著高于对照组(P<0.05)；感染后第3,5天IL-17的表达高于IL-12(P<0.05)，于第7天达到顶峰；IL-12、Dectin-1受体的表达持续上调，于第9天达顶峰(表3)。

表3Dectin-1受体、白细胞介素-17及白细胞介素-12基因mRNA水平

Tab 3mRNA level of Dectin-1 receptor, IL-17 and IL-12 genes

n=6. Dectin-1受体：树突状细胞相关性C型凝集素-1受体； IL-17：白细胞介素-17；IL-12：白细胞介素-12. 实验组与对照组指标各截点比较，#：P<0.05.

3　讨　论

小鼠角膜Dectin-1受体是主要的模式识别受体(pathogen recognition receptors,PRRs)之一，分布于单核巨噬细胞、中性粒细胞上，能够识别烟曲霉病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patten,PAMP)即β(1,3)-葡聚糖，参与对烟曲霉菌的识别、杀菌等作用[2]。研究表明，Dectin-1识别真菌β-(1,3)-葡聚糖后诱导吞噬细胞激活聚集及产生细胞因子，以抵抗曲霉菌感染[3]。Dectin-1受体还参与了小鼠获得性免疫及其细胞因子的炎症反应。Dectin-1受体能直接驱动小鼠获得性免疫，包括小鼠Th1细胞和Th17细胞[4]。研究显示，Th17细胞是小鼠对抗真菌感染的免疫基础，Th17细胞在体内通过Dectin-1受体途径直接触发IL-17抵抗真菌感染[5]。Th1细胞通过触发炎症细胞因子IFN-γ、IL-12等，驱动免疫应答，清除真菌病原[6]。但关于Dectin-1受体抗角膜真菌感染的免疫反应具体机制尚不明确。

研究发现，支气管感染烟曲霉菌Dectin-1-/-小鼠与支气管感染烟曲霉菌野生小鼠比较，肺部病原负荷相对更重，聚集到感染部位的单核巨噬细胞、中性粒细胞较支气管感染烟曲霉菌野生小鼠组明显减少，相关炎症细胞因子的表达量及生存率明显降低，ROS反应的触发受到抑制[7]。笔者发现，通过体外模拟活化巨噬细胞真菌性角膜炎的过程，用曲霉菌刺激小鼠巨噬细胞激活，随着感染时间延长，小鼠角膜巨噬细胞表面的Dectin-1受体的mRNA表达水平持续上调，于第9天达高峰，说明在病程早期，真菌表面的β(1,3)-葡聚糖可能驱动Dectin-1信号通路，触发角膜对真菌的抵御作用，清除病原负荷。因此，笔者推测，Dectin-1受体可能作为一种角膜巨噬细胞模式识别受体，参与活化后巨噬细胞真菌性角膜炎的免疫进程。

Saijo等发现，虽然Dectin-1信号通路同时诱导Th17和Th1细胞分化，但是优先驱动Th17细胞分化[8]。支气管烟曲霉菌感染Dectin-1-/-小鼠与烟曲霉菌支气管感染野生型小鼠相比，IL-17表达下调、IL-23表达增加，病原负荷更重，Th1细胞免疫通过产生IL-12 p40 IFN-γ发挥主导作用[9]。笔者的研究也发现，感染后第1,3,5,7,9天实验组IL-17、IL-12基因mRNA的表达显著高于对照组。第3,5,7天IL-17基因mRNA的表达高于IL-12基因mRNA的表达。笔者推测，Dectin-1信号通路可能直接诱导获得性免疫，包括Th1和Th17细胞，上调IL-17、IL-12的表达，构成了角膜清除真菌的免疫防线。

研究表明，正常角膜中不存在CD4+细胞，Th17在抗真菌感染中具有保护性作用。Huang等报道，IL17受体基因缺失小鼠与野生型小鼠相比，肾部感染第3天念珠菌负荷明显增加，清除病原能力、生存率显著降低[10]。这与本实验组角膜真菌负荷减轻表现一致。笔者推测，Dectin-1的信号通路优先触发Th17细胞分化，Th17细胞的激活具有保护性作用，在清除真菌病原中发挥重要作用。

小鼠角膜炎中有效的抗真菌免疫应答，需要Th17/Th1细胞免疫应答相互平衡。受真菌感染后，Th1细胞通过诱导IL-12及IFN-γ等介导免疫应答。由单核巨噬细胞分泌的IL-12是Th1型细胞的主要激动剂，进一步触发Th1型细胞分化，持续上调IL-12、IFN-γ等。但是，Th1细胞免疫应答通路中的IFN-γ将抑制Th17细胞分化[11]。笔者推测，在本研究中，角膜感染第7天，实验组IL-17和IL-12表达总量达到高峰，角膜中央溃疡、明显有水肿，伴坏死病灶或穿孔炎症反应剧烈。对照组Th1细胞免疫发挥主导作用，IFN-γ抑制Th17细胞分化，清除病原负荷，角膜中央轻度水肿伴灰白色混浊，广泛分布新生血管，炎症损害相对较轻。若降低Dectin-1的表达水平，能否减轻炎症损伤组织的作用及Dectin-1的表达与Th1、Th17之间的相互关系，有待进一步研究。

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(编辑:张慧茹)

The Expression of Dectin-1 Receptor, Interleukin-17 and Interleukin-12 in Mice Fungal Keratitis after the Activation of Macrophage

DONG Chenghuan， ZHENG Xiaoqian， XU Guoxing

Department of Optometry & Ophthalmology, School of Medical Technology and Engineering, Fujian Medical University,Fuzhou 350005, China

ObjectiveTo investigate expression level of c-type lectin-1 receptor (dectin-1), interleukin-17(IL-17) and interleukin-12 (IL-12) in mice afflicted with fungal keratitis after the activation of macrophages.MethodsPrior to the infection ofFusariumsolani, BALB/c mice received subconjunctival injection of latex beads or liposomes containing phosphate-buffered saline (PBS-LIP) in the corneas to establish the experimental group or the control group, respectively.After infection, the morphological features of fungal keratitis were examined under the slit-lamp and microscope at day 1, 3, 5, 7, 9 and the histopathological changes were analyzed by H-E staining.The cytokine mRNA levels of IL-12, IL-17, and dectin-1 in the cornea were measured by real-time PCR.ResultsThe experimental group presented heavy inflammation, diffuse opacity, zero neovascularization, and corneal perforation at day 7; the control group showed diffuse opacity, extensive neovascularization at day 5, but no corneal perforation.Histopathologic examination of corneas found in the experimental group marked dense inflammatory cell infiltration and damage of the corneal stroma at day 5; The mRNA expressions of dectin-1, IL-17, and IL-12 in the experimental group were markedly enhanced at day 3,5,7,9 when compared with those in the control group.ConclusionDectin-1, IL-17, and IL-12 may play an important role in host defense against corneal infection ofF.solani.

keratitis； eye infections, fungal； macrophages； agglutinins； Th1 cells/immunology； T-lymphocytes； interleukins

2015-07-06

福建省教育厅科技项目(JA14136)

福建医科大学 医学技术与工程学院眼视光学系，福州350005

董骋寰(1986-)，女，医学硕士

徐国兴. Email：fjmuxuguoxing@hotmail.com

R329.24； R331.125； R392； R392.12； R519； R772.21

A

1672-4194(2016)02-0103-04