窖泥高产己酸菌分离鉴定及培养条件优化的研究

彭　兵，祝　熙，李忠奎，张宝年，程　伟，陈兴杰，谢国排，杨牢记，黄训端，张部昌*

（安徽大学金种子酒业产业技术研究院，安徽合肥230601）

窖泥高产己酸菌分离鉴定及培养条件优化的研究

彭兵，祝熙，李忠奎，张宝年，程伟，陈兴杰，谢国排，杨牢记，黄训端，张部昌*

（安徽大学金种子酒业产业技术研究院，安徽合肥230601）

浓香型白酒的主体香味物质是己酸乙酯，己酸菌是重要的功能菌种。该研究从优质窖泥中分离获得了高产己酸菌株，命名为JZZ，该菌是革兰氏阳性杆菌，经形态学和16S rDNA序列鉴定，属于克氏梭菌（Clostridium kluyveri）。通过培养条件考察，该己酸菌最适培养条件为接种量5%，装样量90%，培养温度37℃，pH值为6.5。在最适培养条件下，菌株JZZ的己酸产量均可达到4.36 mg/m L。

窖泥；己酸菌；分离；鉴定；培养条件

白酒酿造在我国有着悠久的历史，因原料、酒曲和生产工艺以及自然环境等因素的差别，形成了各具特色、风格迥异的多种香型的白酒，其中浓香型白酒具有芳香浓郁、绵柔甘洌、香味协调、入口甜、落口绵、尾净余长等特点，成为白酒行业的主流产品［1］。构成浓香型酒典型风格的主体成分是己酸乙酯，这种成分含香量较高且香气突出。在传统固态浓香型白酒酿造过程中，窖泥的作用是至关重要的，窖泥微生物的种类、数量、种群间的相互作用以及代谢的多样性直接影响着白酒的质量，其中就包含大量的己酸菌。己酸菌含量的多少以及产己酸能力的高低都直接影响着浓香型大曲酒酒体风格的形成［2-3］。己酸菌代谢所产生的己酸在白酒中不仅起到呈香、助香、减少酒体刺激的作用，而且可以与酒曲发酵产生的酒精发生酯化反应，生成浓香型白酒的所特有的主体香成分己酸乙酯，从而改善浓香型白酒的风味及口感，影响浓香型白酒的风格和质量［4-5］。因此浓香型白酒窖泥微生物群落研究一直是业界研究热点，特别是一些主要功能菌的分离纯化及窖池微生物的群落特征进展迅速［6-8］。赵辉等［9］从浓香型白酒窖泥中分离出3株高产己酸的兼性厌氧细菌，并用气相色谱法检测其己酸产量分别为2.13 m g/m L、1.70 mg/m L和1.03 mg/m L。熊俐等［10］分离出一株高产己酸菌，通过诱变，用醋酸铜比色法测得其己酸产量达到9.02 mg/m L。

本实验从曲酒发酵池的优质窖泥中分离、纯化、筛选出高产己酸的己酸菌，并进行分子生物学鉴定，考察其高产己酸培养条件，为窖池养护及人工窖泥培养提供优质的功能菌株。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料

窖泥：取自某酒厂13个优质浓香型大曲酒发酵池，分别命名为JKY1-JKY13。

1.1.2试剂

硫酸铵、磷酸氢二钾、醋酸钠、碳酸钙、Fe2（SO4）3、乙醇、牛肉膏、NaCl、细菌基因组DNA提取试剂盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母粉、蛋白胨：英国OXOID公司；厌氧袋、耗氧剂：日本MGC公司；己酸（色谱纯）、内标物2-乙基丁酸（色谱纯）：成都西亚试剂公司；乙醇、乙醚：国药集团化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯。

1.1.3培养基

乙醇醋酸钠培养基（ethanol acetic acid-Na medium，EAM）：NaAc 5 g、酵母膏1 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO40.4 g、（NH4）2SO40.5 g、CaCO310 g，蒸馏水1 L，自然pH；121℃灭菌20 m in，乙醇2.0%（灭菌后使用前加入）。

LB培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 L，pH 7.4，121℃灭菌20 m in。

1.2仪器与设备

LRH-250F生化培养箱、DHG-9145A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；Velocity 18R台式冷冻离心机：澳大利亚Dynamica公司；Spectramax 384plus分光光度计：美国MD公司；2010型气相色谱仪（配氢火焰离子化检测器、全自动进样器、自动进样针）：日本岛津公司；DB-FFAP色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国安捷伦公司。

1.3实验方法

1.3.1高产己酸菌的分离纯化

EAM培养基第一次富集：培养基试管装液量90%，加入1 g窖泥，80℃水浴热处理10 m in，封口膜封口，37℃培养7 d。分别取第一次富集菌液2 m L，加2 m L 2%CuSO4，1 m L乙醚，摇匀，静置封层，观察乙醚层显色反应（硫酸铜显色法）［9］，将OD值较高的组别进行气相色谱法复测，然后将气相色谱法复测己酸产量较高的组别进行第二次富集。第二次富集的培养液，吸取1～9 m L的无菌水中，依次稀释到10-4稀释度，选取10-3和10-4的菌液，吸取0.2 m L到已倒好的分离用平板培养基上，每个梯度重复3次，涂匀后放置于真空干燥箱中，37℃培养7 d。然后在稀释涂平板的平皿上挑取单菌落挑至装有EAM液体培养基的15 m L试管中（装样量90%）中37℃厌氧培养7 d。用硫酸铜显色法测定波长680 nm条件下的吸光度值，对发酵液初筛后，气相色谱法进行己酸菌己酸产量的测定。

1.3.2菌株鉴定

单菌落形态观察，经革兰氏染色后镜检。

提取菌株基因组，PCR扩增16S rDNA片段，聚合酶链反应（polymerasechain reaction，PCR）扩增程序：95℃、5min，95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、90 s，24个循环，72℃、10 min。由上海美吉生物医药科技有限公司进行测序，提交美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI），通过基本本地队列搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行同源性比较，用MEGA6软件构建系统发育树［11］。

1.3.3高产己酸菌培养条件的研究

将研究中挑选到的高产己酸菌分别按照2%、5%、10%、15%的种子液接种量接种到pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 EAM液体培养基的15 m L试管，装样量分别为60%、70%、80%、90%、100%，分别在36℃、37℃、38℃、39℃、40℃厌氧培养7 d后，考察接种量、pH值、装液量及培养温度对己酸产量的影响，每个样品3个重复。

1.3.4己酸产量的测定

采用气相色谱法检测己酸产量，气相色谱条件为进样口温度240℃；柱箱起始温度：100℃（1 min）；升温速率：10℃/min；柱温终温度：220℃（2 min）；检测器温度250℃；气体流量：氢气40 m L/m in，空气400 m L/min，尾吹气30 m L/min；进样方式：分流进样，分流比20∶1；进样体积：1 μL。

内标液的配制：准确称取内标物2-乙基丁酸原液0.185 g于100 m L容量瓶中，用体积分数为60%乙醇水溶液定容至100m L，配制成1.85mg/m L 2-乙基丁酸内标液待用。

2　结果与分析

2.1高产己酸菌分离

本研究利用硫酸铜比色法检测己酸菌的己酸产量，对菌株进行初筛，筛选到一株稳定高产的己酸菌，命名为JZZ，然后对菌株JZZ的己酸产量用气相色谱法进行复测，结果见表1。由表1可知，菌株JZZ的己酸产量的6次检测结果分别为4.33 mg/m L、4.25 mg/m L、4.28 mg/m L、4.55 mg/m L、4.34 mg/m L、4.42 mg/m L，平均值为4.36 mg/m L，菌株JZZ是一株高产己酸菌。

表1　菌株JZZ己酸产量的复测Table 1 Retest of caproic acid yield for strain JZZ

2.2菌株JZZ的菌落形态观察

经过菌落形态及革兰氏染色观察，结果见图1。由图1可知，菌株JZZ为革兰氏阳性杆菌，顶端有芽孢，菌落呈白色圆形，扁平，表面光滑且周围有较为明显的透明圈。

图1　菌株JZZ的菌落形态（A）及细胞形态（B）Fig．1 Colonial morphology（A）and cell morphology（B）of strain JZZ

2.3筛选菌株JZZ的16S rDNA鉴定结果

经上海美吉生物医药科技有限公司测序分析，得到菌株JZZ的16S rDNA序列信息如下：

GTGGGTAACCTGGCTCAAAGAGGGGGATAGCC TCCCGAAAGGGAGATTAATACCGCATAAAAGGTAAATATCGCATGGTAAATACCTTAAAGGAGAAATCCG CTTTGAGATGGGCCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGA GGGATAAAAGCCCCCCAAGGCGACGATGCGTAGCC GACCTGAGAGGGTGAACGGCCACATTGGAACTGAG ATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG GAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCA ACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA AGCTCTGTCATCCGGGACGATAATGACGGTACCGG AAGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC GCGGTAATACGTAGGTGGCGAGCGTTGTCCGGAAT TACTGGGCGTAAAGGGTGTGCAGGCGGATATTTAA GTGAGATGTGAAAGACCCGGGCTTAACCCGGGCAG TGCATTTCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGG AGAACGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTA GAGATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGATTC TCTGGACTGTAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTG GGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG CCGTAAACGATGAGTACTAGGTGTAGGGGGTATCG ACCCCCCCTGTGCCGCAGTAAACACAATAAGTACTC CGCCTGGGAAGTACGATCGCAAGATTAAAACTCAA AGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGCGGAGCA TGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC TGGACTTGACATCCCCTGAATAACTCGTAATGGAGG AAGCCCTTCGGGGCAGGGAGACAGGTGGTGCATGG TTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAG TCCTGCAACGAGCGCAACCCCTGTCGTTAGTTGCCA TCACGTAAAGGTGGGCACCCTAACGAGACTGCCGC GGTTAACGTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAAT CATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCAACACACGTGCT ACAATGGGCAGAACAGAGAGAAGCAATACCGCGAG GAGGAGCAAATCTCAAAAACTGCCCCCAGTTCGGA TTGCAGGCTGAAACCCGCCTGCATGAAGTTGGAGTT GCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATA CGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCC。

将菌株JZZ的16S rDNA序列在NCBI中进行同源性比较，同源性较高的为克氏梭状杆菌（Clostridium kluyveri），同源性＞99%。采用软件构建系统发育树，结果见图2。

图2　菌株JZZ的16S rDNA的系统发育树Fig．2 Phylogenetic tree of 16S rDNA of strain JZZ

一般认为，在细菌分类学上16S rDNA的同源性＞97%的为属内同种。由图2结果综合菌株JZZ的形态与分子生物学特征可知，菌株JZZ鉴定为克氏梭状杆菌（Clostridium kluyveri）［12-13］。

2.4高产己酸菌培养条件的研究

通过对接种量、装样量、培养温度及pH分别设置变量，对菌株JZZ的培养条件进行优化，经气相色谱法测定己酸产量的变化，结果见图3。

图3　不同接种量（A）、装样量（B）、培养温度（C）及pH（D）对菌株JZZ己酸产量的影响Fig．3 Effect of different inoculum（A），volume of liquid（B），culture tem perature（C）and pH（D）on caproic acid yield of strain JZZ

由图3A可知，培养7 d后，接种量为5%比2%的己酸产量高，虽然更高的接种浓度己酸产量还在增长，但增长幅度较小，所以5%是合适的接种量。由图3B可知，培养7 d后，乙酸产量装样量从60%到100%呈递增趋势，在装样量＜90%时增幅较大，而90%～100%时增幅较小，综合考虑实验的操作方便性等原因认为90%是合理的装样量。由图3C可知，培养7 d后，培养温度为37℃时己酸产量最高，所以37℃是最合适的培养温度。由图3D可知，pH 6.5条件下培养7 d后，产己酸量最高，所以pH 6.5是最佳pH。

3　结论

本研究通过对某浓香型窖池窖泥分别进行富集、筛选、梯度稀释等工作得到一株高产己酸菌，并命名为JZZ。通过菌落形态、革兰氏染色及16S rDNA分子测序对菌株JZZ进行鉴定，得到的结果为该菌为革兰氏阳性杆菌，属于克氏梭状杆菌（Clostridium kluyveri）。通过对其产己酸条件的优化，得到该菌的最适培养条件为pH值为6.5，接种量为5%，装样量为90%，培养温度为37℃。通过气相色谱法对其己酸产量进行检测，在最适培养条件下，菌株JZZ的己酸产量均可达到4.36 mg/m L。

在传统的浓香型白酒生产过程中，窖泥经过长时间的使用会出现不同程度的板结和老化，窖泥中的己酸菌等功能菌会出现产己酸功能的衰退及数量的减少，需要定期通过加入含有高产己酸菌养护液对老化的窖泥进行养护，在人工窖泥快速培养中高产己酸菌将起到关键作用［14-16］。本实验筛选得到的高产己酸菌JZZ用于窖泥的日常养护和人工窖泥的快速培养，可改善窖泥的养护效果，缩短人工窖泥老熟的周期，降低生产成本。由于己酸菌的主要产物己酸，是浓香型白酒中关键的风味产物己酸乙酯的前体，所以本研究对于提高和改善浓香型白酒的质量有重要应用价值。

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Isolation and identification of the strains with high caproic acid yield from pit mud and optim ization of cultural conditions

PENG Bing，ZHU Xi，LI Zhongkui，ZHANG Baonian，CHENG Wei，CHEN Xingjie，XIE Guopai，YANG Laoji，HUANG Xunduan，ZHANG Buchang*
（Institute of Industry and Techno logy of Anhui University-Golden Seed W inery，Hefei 230601，China）

Ethyl caproate is primary flavor component of Luzhou-flavor liquor（China Baijiu），and caproic acid bacteria are the important functional strains.The strains w ith high caproic acid yield were isolated from the fine pit mud and named JZZ.The strains were gram-positive bacilli and were identified as Clostridium kluyveri by identification of morphology and 16S rDNA sequence.By researching culture conditions，the optimum culture conditions of caproic acid bacteria were inoculum 5%，liquid volume 90%，culture temperature 37℃and pH 6.5.Under the optimum conditions，the caproic acid yield of strain JZZ could be up to 4.36 mg/m l.

pit mud；caproic acid bacteria；isolation；identification；culture conditions

TS261

0254-5071（2016）05-0043-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．009

2016-02-04

金种子人工窖泥快速培养技术研究（Y 06099204）；安徽大学2015年百门精品素质课程建设项目（ZLTS2015233）

彭兵（1970-），男，高级工程师，本科，主要从事酿造技术研究工作。

张部昌（1965-），男，教授，博士，主要从事生物工程研究工作。