鱼肉蛋白肽在模拟胃肠消化吸收过程中的抗氧化活性和生物利用度

霍艳姣，王 波，郭珊珊，李 博，*，罗永康（.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京00083；.滨州万嘉生物科技有限公司，山东滨州56600）

鱼肉蛋白肽在模拟胃肠消化吸收过程中的抗氧化活性和生物利用度

霍艳姣1，王 波1，郭珊珊2，李 博1，*，罗永康1
（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083；2.滨州万嘉生物科技有限公司，山东滨州256600）

以鳕鱼鱼肉蛋白肽为研究对象，构建体外胃肠消化模型和Caco-2细胞吸收模型，模拟连续的胃肠消化、吸收过程，测定抗氧化活性和生物利用度。结果显示：在模拟胃肠消化过程中，鱼肉蛋白肽的水溶性维生素E抗氧化能力（TEAC）变化不显著（p＞0.05），DPPH自由基清除率在胃消化阶段下降而在肠消化阶段升高（p＜0.05），但低于消化前的水平（p＜0.05）。在模拟转运2 h过程中，鱼肉蛋白肽吸收产物的肽氮含量逐渐增加，TEAC和氧自由基抗氧化能力（ORAC）显著升高（p＜0.05）。鱼肉蛋白肽的生物利用度显著高于鱼肉（9.1%），且分子量最小的蛋白肽的生物利用度最高（46.2%）。鱼肉蛋白肽经胃肠消化吸收后，具有一定的抗氧化活性且生物利用度较高，为鳕鱼蛋白肽的开发利用提供了理论依据。

胃肠消化，Caco-2细胞模型，抗氧化活性，生物利用度

鳕鱼属于海洋深水鱼，是底层冷水性群聚鱼类，主要产于我国的渤海、黄海和东海北部。鳕鱼肉质厚实、脂肪含量低、蛋白含量高、鲜味十足、细刺很少，氨基酸比例与人体所需氨基酸比例很接近［1］，具有很高的营养价值和经济价值。

已有研究证实，鳕鱼蛋白中存在着潜在的生物活性肽段［2］，其营养价值和功能特性明显高于蛋白质或游离氨基酸［3］。活性肽经口服摄入，可能会受胃肠道内多种蛋白酶、肽酶的作用而发生降解，生物活性改变，生物利用度降低［4-5］。通过体外模拟胃肠消化、吸收过程，可以初步研究肽在胃肠环境下的生物活性和生物利用度。体外模拟消化技术，需要根据实际生理参数设定模拟条件［6］，常用的消化模型包括胃蛋白酶和胰酶的水解作用。Caco-2细胞具有与人体小肠上皮细胞相同的酶系统，并且细胞极性、紧密连接性和转运系统相一致［7］，广泛作为肠吸收模型。

鳕鱼鱼皮［8］、鱼骨［9］、鱼肉［10］等蛋白酶解物表现出较好抗氧化活性，并分离鉴定出一个具有抗氧化活性和ACE抑制活性的肽序列（Leu-Leu-Met-Leu-Asp-Asn-Asp-Leu-Pro-Pro）［11］。最近，Sabeena Farvin等［12］采用脂质评价体系研究了鳕鱼蛋白肽的体外抗氧化活性。但是目前，关于鳕鱼源活性肽经胃肠消化后的生物活性和生物利用度的研究还很少，未能真实地反映出活性肽的利用价值。本实验采用体外胃肠消化、吸收模型，研究鳕鱼鱼肉蛋白肽在胃肠消化、吸收过程中的抗氧化活性和生物利用度，并与鱼肉对比，初步评估这些肽的实际利用价值，可为鳕鱼鱼肉蛋白肽的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鳕鱼鱼肉粉（R）和鱼肉蛋白肽粉（H、F1、F2） 均由山东省滨州万嘉生物科技有限公司提供，鳕鱼鱼肉经清洗、绞碎、冻干所得鱼肉粉R，R经动物复合酶酶解制备得到蛋白肽粉H，蛋白肽粉H经3000 u滤膜超滤分离得到分子量不同的肽组分F1（截留组分）和F2（滤过组分）；胰酶（P1750，250NF U/mg） 美国AMRESCO公司；胃蛋白酶（P7000）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、水溶性维生素E（Trolox）、荧光素钠、还原性谷胱甘肽、1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH） 美国Sigma-Aldrich公司；偶氮二异丁脒盐酸盐（AAPH） 上海源叶生物科技有限公司；十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、过硫酸钾、盐酸等其他试剂 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；Transwell 6孔板（Nunc，孔径0.4 μm，面积4.2 cm2） 北京康碧泉生物科技有限公司；DMEM（HyClone，SH30022.01B） 赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，安捷伦） 北京五洲东方科技发展有限公司；合成肽MPFPK（618.32 u）、KNQDKTEIPT（1173u）、LEQQVDDLEGSLEQEK （1859 u）、NLQQEISDLTEQLGETGK（2003 u） 上海强耀生物科技有限公司。

HZS-HA恒温水浴振荡器 黑龙江省哈尔滨东联电子技术开发有限公司；722S可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；Infinite 200Pro多功能酶标仪 瑞士帝肯（Tecan）公司；LGJ-18冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；UD1000A酶标仪 北京联众泰科科技有限公司；LC-15C高效液相色谱 岛津国际贸易（上海）有限公司；BBD6220 CO2的培养箱 美国热电公司；Millicell-ERS跨膜电阻仪 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 氨基酸组成分析 采用HPLC-异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生法对鱼肉蛋白肽粉（H、F1、F2）和鱼肉粉R进行氨基酸组成分析的测定［13］。样品的处理和洗脱条件参考谢宁宁［14］实验方法。以氨基酸标品洗脱得到的图谱为标准图谱，从而对样品的氨基酸进行定性和定量。

1.2.2 体外模拟胃肠消化 参照王婵［15］模拟胃肠消化的方法。样品R、H、F1和F2先进行胃消化，其产物分别记作R-G、H-G、F1-G和F2-G；而后进入肠消化阶段，其产物分别记作R-GI、H-GI、F1-GI和F2-GI。

在胃肠消化过程中，每0.5 h取2 mL消化液，置于沸水浴中灭酶15 min，冷却室温，并将pH调至7.0，于-4℃保存，用于测定抗氧化活性。

1.2.3 分子量分布的测定 鱼肉粉R采用SDS-PAGE凝胶电泳测定其蛋白的分子量［16］。根据溶解性的差异分离提取水溶性蛋白、盐溶性蛋白和肌基质蛋白。肌基质蛋白不溶盐或碱溶液，因此本实验只测定水溶性蛋白和盐溶性蛋白的分子量。

鱼肉蛋白肽样品H、F1、F2与其对应胃肠消化产物H-GI、F1-GI、F2-GI的分子量测定采用HPLC法［13］。采用的分析柱为TSK gel G2000 SWXL（7.8 mm×300 mm）。以标准品（合成肽）洗脱时间对分子量的对数值作图得到标准曲线y=-0.1881x+6.5867（R2=0.9954，y：log MW，x：洗脱时间）。

1.2.4 Caco-2细胞模型模拟肠吸收

1.2.4.1 Caco-2细胞培养 参考Ohsawa［17］的实验方法。Caco-2细胞培养基是含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%的双抗（100 U/mL的青霉素和0.1 mg/mL的链霉素）的DMEM培养液。在37℃、相对湿度90%、5%的CO2的培养箱中进行培养。待细胞状态良好时进行消化后接种于6孔Transwell板的上侧，同时下侧加入3 mL培养液。通过Millicell电阻仪测定跨膜电阻以检测细胞的完整性，当跨膜电阻达到800 Ω以上时，可作为吸收转运模型。

1.2.4.2 模拟转运吸收 参照Kotzé［18］的实验方法。模拟实验开始前，分别将胃肠消化产物H-GI、F1-GI、F2-GI和R-GI用Hank's平衡盐溶液（HBSS）配制浓度为10 mg/mL。用37℃预温的HBSS清洗Caco-2单层细胞上侧和下侧，在上侧添加1.5 mL溶于HBSS的样品，在下侧添加3 mL的HBSS。置于37℃细胞培养箱中孵育。设置细胞转运0.5、1、2 h实验组，每组三个重复。分别收集下侧吸收的溶液，冷冻干燥，-80℃低温保存备用。以溶剂HBSS代替样品作为空白对照，茶多酚为阳性对照。

1.2.5 抗氧化活性的测定

1.2.5.1 水溶性维生素E当量抗氧化能力（TEAC）的测定 TEAC法，即测定ABTS自由基清除率，在Re［19］的研究方法基础上合理改进，并参照王婵［14］的具体实验步骤，以谷胱甘肽（GSH）为阳性对照。以水溶性维生素E（Trolox）的浓度（mmol/L）为横坐标，ABTS自由基清除率为纵坐标，绘制标准曲线y=37.932x-0.3969 （R2=0.9971），待测样品的ABTS自由基清除率换算成Trolox的当量。

1.2.5.2 DPPH自由基清除率 参照Li等［20］的实验方法。

1.2.5.3 氧自由基抗氧化能力（ORAC）的测定 ORAC测定方法采用Ou［21］提出的以荧光素钠盐作为荧光物质的方法，并经Dávalos［22］进行了改进。采用黑色96孔酶标板，先将20 μL吸收产物（20 μg/mL）和120 μL荧光工作液（70 nmol）加入每个小孔内，于37℃条件下孵育12 min，之后采用排枪添加60 μL的AAPH溶液（12 mmol），迅速将酶标板放入多功能酶标仪内，进行测定。采用PBS代替样品作为空白对照。酶标仪参数设置：荧光模式，激发光485 nm，发射光520 nm，温度37℃，检测时间120 min，每1 min读数一次。净面积Net AUC=AUC样品-AUC空白。

以Trolox浓度（mmol/L）为横坐标，净面积Net AUC为纵坐标绘制Trolox标准曲线y=18358x+14443（R2=0.9918）。待测样品的Net AUC值均换算成Trolox的当量。

1.2.6 总氮与肽氮含量的测定 总氮与氨基氮的测定参照Xie［23］的实验方法。肽氮含量等于样品总氮含量减去氨基氮的含量。生物利用度为转运吸收产物总氮含量与对应样品总氮含量的百分比。鱼肉和蛋白肽粉样品经消化后，鱼肉样品仍有沉淀物，而肽处于全部溶解状态，它们的消化率有很大差异。消化率为去沉淀的消化产物质量与原样品质量的百分比。

1.2.7 数据处理与统计分析 采用SPSS 17.0软件进行相关性分析，利用Duncan进行数据显著性差异分析，显著水平（α=0.05）。其他图表制作与数据分析均采用Excel 2010处理。

2 结果与分析

2.1 鱼肉蛋白肽及鱼肉样品的氨基酸组成分析

鳕鱼鱼肉蛋白肽H、F1、F2和鱼肉R的氨基酸组成结果见表1。由表1可知，H、F1和F2与R的氨基酸组成存在不同程度的差异。F2与H、F1相比，酸性氨基酸、甘氨酸、脯氨酸含量明显减少，碱性氨基酸、亮氨酸含量增多。H、F1、F2和R四个样品中酸性氨基酸含量均较高，占氨基酸总量的20%以上（除F2外，18.91%），而半胱氨酸含量很少，这与邓放明［1］测定鳕鱼肌肉氨基酸组成的结果相似。氨基酸的疏水性、电荷性等因素都可能与抗氧化活性和胃肠耐受能力有关。

天冬氨酸、谷氨酸是呈鲜味类氨基酸，丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸等是主要呈甜味类氨基酸［24］，鳕鱼鱼肉呈鲜味和甜味氨基酸含量约占总量的50%。鳕鱼鱼肉中必需氨基酸含量也很高，占30%以上，尤其是赖氨酸较为丰富，而赖氨酸是人体第一必需氨基酸。从氨基酸上来看，鳕鱼鱼肉蛋白肽的营养价值很高。

2.2 模拟胃肠消化前后分子量分布

鱼肉蛋白肽H、F1、F2与其对应的胃肠消化产物H-GI、F1-GI、F2-GI的分子量测定结果如表2所示。由表2可知，在模拟消化前，鱼肉蛋白肽样品（H、F1、F2）的分子量主要分布在3 ku以下。样品H、F1分子量主要分布在500～1000 u范围内；样品F2主要由低于500 u的肽组成，占54.74%。经过胃肠消化后，鱼肉蛋白肽样品胃肠消化产物（H-GI、F1-GI、F2-GI）分子量分布有些变化，分子量大的肽比例减少，低于500 u肽部分的比例增加，但变化程度不大。鱼肉蛋白R经SDS-PAGE凝胶电泳测得蛋白分子量在60～200 ku，经胃肠消化的产物R-GI的分子量范围较广（200 u～8 ku），主要集中在1～3 ku，占59.27%。

鱼肉蛋白肽样品本身的分子量较小（1 ku以下为主），可能受胃蛋白酶、胰酶水解作用的影响较小，更耐受胃肠的消化。而鱼肉蛋白则在胃肠消化过程发生强烈的水解作用，生成很多肽类和氨基酸。活性肽通常由2～20个氨基酸残基组成，分子量在6 ku以下［25］。分子量的大小往往与活性肽的抗氧化活性有关［26］。

表1 鱼肉蛋白肽及鱼肉氨基酸组成Table1 The amino acid composition of protein peptides and fish meat

表2 鱼肉蛋白肽胃肠消化前后分子量分布Table2 The molecular weight distribution of fish protein peptides before and after gastrointestinal digestion

2.3 模拟胃肠消化过程中抗氧化活性的变化

2.3.1 TEAC活性 鱼肉蛋白肽（H、F1、F2）在胃肠消化过程中的TEAC活性变化结果如图1所示。由图1 （A、B）可知，H、F1、F2（10 mg/mL）在消化过程中，TEAC活性强弱始终为F2＞H＞F1，并具有显著性差异（p＜0.05）。在胃消化（0.5～2 h）、肠消化（0～2 h）过程中，H、F1、F2的TEAC活性变化不显著（p＞0.05）。在胃肠消化结束时，鱼肉蛋白H的胃肠消化产物（10 mg/mL）的TEAC活性与0.2 mg/mL GSH抗氧化水平相当。样品鱼肉R从肠消化阶段才具有TEAC活性，并显著低于鱼肉肽消化物的TEAC活性（p＜0.05）。鱼肉蛋白肽（H、F1、F2）在模拟胃肠消化过程中，TEAC活性保持稳定，这说明样品可能比较耐受胃蛋白酶、胰酶的水解作用，未能影响ABTS+自由基的清除能力。鱼肉R经胃蛋白水解后仍无抗氧化活性，而在胰酶的水解作用下，生成具有抗氧化活性的肽，TEAC活性急剧升高。

图1 鱼肉蛋白肽及鱼肉胃肠消化过程中TEAC活性的变化Fig.1 Change of TEAC activity of protein peptides and fish meat during gastrointestinal digestion

2.3.2 DPPH自由基清除率 鱼肉蛋白肽（H、F1、F2）在胃肠消化过程中，DPPH自由基清除率的测定结果如图2所示。由图2（A）可知，在未消化前即0 h时，H、F1、F2（10 mg/mL）的DPPH自由基清除率分别为62.21%、53.50%、43%，且数据间具有显著性差异（p＜0.05）。与0 h相比，经胃消化2 h后，H、F1、F2各自的DPPH自由基清除显著下降（p＜0.05）。由图2（B）可知，在肠消化0.5 h内，H、F1、F2对应的胃消化物H-G、F1-G、F2-G（10 mg/mL）的DPPH自由基清除能力显著降低（p＜0.05），并在肠消化0.5～2 h过程中显著升高（p＜0.05），但低于消化前样品的水平。最后在肠消化2 h结束时，H-G、F1-G、F2-G肠消化物DPPH自由基清除率分别为30.01%、28.47%、26.31%，并无显著性差异（p＞0.05）。鱼肉R在胰酶作用下发生强烈水解，DPPH自由基清除率显著升高（p＜0.05），但低于鱼肉蛋白肽（H、F1、F2）。经过胃肠消化，鱼肉蛋白肽样品中的某些肽发生降解，导致对DPPH自由基的清除率降低，但还是高于鱼肉蛋白的抗氧化活性。

图2 鱼肉蛋白及肽组分胃肠消化过程中DPPH清除率的变化Fig.2 Change of DPPH scavenging capacity of protein peptides and fish meat during gastrointestinal digestion

分别采用DPPH和TEAC法测定抗氧化性，三个鱼肉蛋白肽样品（H、F1、F2）的活性强弱结果并不一致，未能比较哪个样品抗氧化活性最好，这是因为这两种抗氧化活性测定方法的原理不同。通常评价物质的抗氧化活性，会采用多种方法来综合评价。

2.4 模拟吸收过程中肽氮含量和抗氧化活性的变化

2.4.1 肽氮含量的变化 鱼肉蛋白肽的胃肠消化物（H-GI、F1-GI、F2-GI）在模拟转运过程中，肽氮含量的测定结果如图3所示。随着转运时间的延长，各吸收产物的肽氮含量均升高。在模拟转运2 h结束时，H-GI、F1-GI、F2-GI的吸收产物中肽氮含量无显著性差异（p＞0.05）。

图3 模拟吸收过程中肽氮含量的变化Fig.3 Change of peptide nitrogen content during simulated intestinal absorption

机体不仅存在氨基酸转运系统，还有肽转运系统［27］，吸收的氨基酸来补充体内氨基酸，起到补充营养的作用；而以肽形式被吸收，则主要与生理活性有关。肽氮含量是通过检测多肽的氨基端来定量的，本实验肽氮含量的结果可以大致反映出肽含量。经吸收的肽，可能有潜在的生理活性，这将在机体健康保护方面具有重要的意义。

2.4.2 抗氧化活性的变化 H-GI、F1-GI和F2-GI （10 mg/mL）经单层Caco-2细胞模拟转运吸收，其吸收产物的抗氧化活性测定结果如图4所示。随着转运时间的延长，吸收产物的TEAC、ORAC活性显著升高（p＜0.05）；在转运2 h结束时，F2-GI吸收产物的TEAC活性显著高于H-GI、F1-GI（p＜0.05），但它们的ORAC活性无显著性差异（p＞0.05）。阳性对照茶多酚在转运60 min内，TEAC、ORAC活性接近最高水平。鱼肉的消化率很低（29.2%），所以同等质量的鱼肉蛋白肽和鱼肉经胃肠消化吸收，鱼肉蛋白肽比鱼肉抗氧化活性高。

图4 模拟吸收过程中TEAC、ORAC活性的变化Fig.4 Change of antioxidant activity（TEAC、ORAC）during simulated intestinal absorption

鱼肉蛋白肽吸收产物的抗氧化活性随时间延长而升高，这可能是由于具有抗氧化活性的肽增加（图4肽氮含量增加），提高了抗氧化能力。本实验收集的吸收产物，大部分是缓冲盐，实际的肽和氨基酸的浓度很低，必须用灵敏的抗氧化活性测定方法。TEAC 和ORAC方法比较灵敏，对抗氧化物的浓度要求很低，所以很适合吸收产物抗氧化活性的测定。

2.5 生物利用度

鱼肉蛋白肽与鱼肉的生物利用度的测定结果如图5所示，鱼肉蛋白肽H、F1和F2的生物利用度均高于鱼肉（9.1%），且F2的生物利用度最高（46.2%），并具有显著差异（p＜0.05）。鱼肉经胃肠消化后，离心去掉不溶物，导致消化得率低，而蛋白肽为全溶解状态，视为100%。由此可知，鱼肉蛋白肽更易被机体吸收利用。

图5 鱼肉蛋白肽及鱼肉的生物利用度Fig.5 The bioavailability of protein peptides and fish meat

3 结论

鱼肉蛋白肽经胃肠消化、吸收后，仍具有一定的抗氧化活性，生物利用度也显著高于鱼肉（p＜0.05）。实验中的三个鱼肉蛋白肽样品的分子量较小（＜1 ku为主），经胃肠消化吸收后，抗氧化活性差异小，但生物利用度有显著差异（p＜0.05），分子量最小（＜500 u为主）的鱼肉蛋白肽的生物利用度最高。与鱼肉相比，鱼肉蛋白肽更容易被机体吸收利用，在体内的抗氧化活性相对更高，营养价值也更高。本研究结果为鳕鱼鱼肉蛋白肽的开发利用提供了理论基础。

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Antioxidant activity and bioavailability of the Pacific cod meat peptides during simulated gastrointestinal digestion and absorption

HUO Yan-jiao1，WANG Bo1，GUO Shan-shan2，LI Bo1，*，LUO Yong-kang1
（1.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；2.Binzhou Wan Jia Biological Science and Technology Co.，Ltd.，Binzhou 256600，China）

Antioxidant activity and bioavailability of the Pacific cod（Gadus macrocephalus）protein peptide were determined during in vitro gastrointestinal digestion model and Caco-2 cell monolayer model simulated the process of gastrointestinal digestion and absorption.The results showed that TEAC activity of fish protein peptide had no obvious variation during gastrointestinal digestion，while DPPH scavenging capacity significantly （p＜0.05）reduced after pepsin digestion and obviously picked up but below（p＜0.05）the level of before digestion after intestinal digestion.The peptide nitrogen content and antioxidant activity of the absorption components increased（p＜0.05）during absorption.The bioavailability of protein peptides was higher than fish meat（9.1%），especially，low-molecular-weight fraction of protein peptides had the highest bioavailability （46.2%）.The cod protein peptide had antioxidant activity and pretty bioavailability after gastrointestinal digestion and absorption，which provided theoretical evidence for the cod protein peptide development.

gastrointestinal digestion；Caco-2 cell model；antioxidant activity；bioavailability

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0174-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.027

2015－07－29

霍艳姣（1990-），女，硕士研究生，研究方向：功能食品，E-mail：huoyjiao@cau.edu.cn。

李博（1970-），女，博士，副教授，研究方向：功能食品，E-mail：libo@cau.edu.cn。