日内瓦毛霉对妊娠烯醇酮的生物转化研究

2016-09-16 06:29孙工兵黑龙江金九药业股份有限公司黑龙江密山158306
哈尔滨医药 2016年4期
关键词:毛霉生物转化甾体

孙工兵(黑龙江金九药业股份有限公司,黑龙江 密山 158306)

·论著·

日内瓦毛霉对妊娠烯醇酮的生物转化研究

孙工兵
(黑龙江金九药业股份有限公司,黑龙江 密山 158306)

目的探索日内瓦毛霉微生物对妊娠烯醇酮的生物转化问题。方法将妊娠烯醇酮经生物转化后,发生7-羟基化,得到两种产物,通过红外、核磁、质谱分析,确定其化学结构进行优化研究。结果碳源、氮源对转化率的影响很大,试验最佳的碳源、氮源确定为葡萄糖和蛋白胨,辅助氮源为酵母膏。结论通过单因素条件优化,确定碳源和氮源加量分别为3.6%和1.3%。对不同浓度无机盐KH2PO4对转化率的影响,确定其浓度为0.16%,初始pH为4.5时,最终得到主产物的转化率为59.2%。

甾体;妊娠烯醇酮;日内瓦毛霉;羟基化

在临床应用上,甾体激素是一类重要的激素药物,广泛的应用归因其生理活性[1],这种作用活性于C11上的羟基化作用关系密切。

20世纪50年代美国普强药厂利用微生物黑根霉的羟化酶将黄体酮一步转化成11α-羟基黄体酮[2],即对甾体化合物结构的改造,这一方法成功地解决了皮质激素合成中的最大难题,使微生物转化技术成为甾体药物不可缺少的关键技术。先令公司开发成功的口服避孕药Yasmin(屈螺酮加炔雌醇),在美国和欧洲早已上市,7a,15α-二羟基雄烯醇酮是合成屈螺酮的重要中间体,直接转化方法简单,副产物少[3]。研究表明,去氢表雄酮(DHEA)的7-羟基衍生物对治疗癌症和阿尔茨海默病有重要疗效,同时它还具有抗糖皮质激素作用、增强机体免疫功能和促进减肥功效[4]。

本研究选择日内瓦毛霉对妊娠烯醇酮生物转化的研究,对转化条件进行了优化的同时,获得了具有超强生物活性潜力的7-羟基甾体衍生物。7-羟基甾体衍生物的产率得到了进一步的提高,为新药的开发和设计奠定了良好的基础。

1 材料

1.1菌种:日内瓦毛霉(M.genevensis),自筛,经中国微生物菌种保藏管理委员会,农业微生物中心(ACCC)鉴定为日内瓦毛霉。

1.2培养基:分离培养基:马铃薯200 g/L,葡萄糖20 g/L,琼脂20 g/L,少量甾体;酵母膏培养液:蛋白胨12 g/L,葡萄糖40 g/L,磷酸二氢钾1.3 g/L,酵母膏1 g/L,用1 mol/L HCl调pH为4.5;斜面培养基:马铃薯200 g/L,葡萄糖20 g/L,琼脂20 g/L,pH为4.5。

2 方法

2.1薄层层析(TLC):称取27 g硅胶G置具塞三角瓶中,加3 g石蜡和50 mL三氯甲烷,制备成0.25 mm厚的硅胶薄层层析板(75 mm×25 mm);浓硫酸∶甲醇=1∶1为显色剂;丙酮∶石油醚=1∶3(V/V)作展开剂。样品用上行法展开,将层析板浸于显色液中取出,用电吹风机吹干,吹干后用显色剂喷雾,放在电热板上加热显色。

2.2菌种分离筛选:标本采集:在选好适当地点后,取1 g土壤置于已灭菌的试管中,加10 mL无菌水,漩涡振荡器振荡摇匀,静置,取上清液,滴于培养基中,再用玻璃棒涂匀。置27℃恒温培养箱中培养1~5 d后,从分离培养基中挑出单菌落,在相同条件下继续培养1~5 d后,将纯化的菌株移置到斜面培养基上,编号保存。将甾体底物进行发酵培养,用薄层层析技术检测,选出具有转化甾体能力的优良菌株。将初筛后得到的菌株再次进行甾体转化试验,复筛出转化甾体效果更好的菌株。

2.3甾体转化试验:取1支斜面菌种,用接种针将菌种加入已灭菌的装有发酵液100mL的锥形瓶中。27℃,220 r/min振荡培养2 d,将1.5 g妊娠烯醇酮溶于30 mL丙酮中,在每瓶已生长的菌液中加入2 mL丙酮溶液,相同条件下继续发酵培养4 d。

2.4甾体转化产物的分离与分析:用乙酸乙酯将发酵液和菌丝体,减压蒸馏萃取6次后,合并有机相,真空旋转蒸发仪蒸去溶剂,真空干燥,柱层析分离,得到产物粗品后,以MS、IR和2D-NMR波谱技术鉴定结构。

3 结果

3.1菌种的分离与筛选:细菌、放线菌和真菌均具有甾体羟基化作用的微生物,我们用从土壤中筛选出的菌种进行发酵试验,筛选时选用妊娠烯醇酮作为底物,最终获得了转化能力强、效果较好的菌株日内瓦毛霉。

3.2甾体生物转化产物的分离:在用硅胶柱层析技术分离产物时,曾经选用了丙酮-石油醚、丙酮-二氯甲烷、丙酮-氯仿、氯仿-乙酸乙酯、氯仿-甲醇等体系进行试验。结果发现,在妊娠烯醇酮(1)的生物转化中,以丙酮∶石油醚(1∶3)作展开剂,可以成功地将混合物分开,效果良好。

3.3日内瓦毛霉对妊娠烯醇酮的转化:妊娠烯醇酮在用Mucor genevensis进行生物转化时,生成7α,11α-二羟基妊娠烯醇酮2和7α,11β-二羟基妊娠烯醇酮3。通过红外、质谱分析、核磁等方法,确定其化学结构分别是7α和11α-二羟基妊娠烯醇酮2,7α和11β-二羟基妊娠烯醇酮3,详见表1。

表1 硅胶柱层析技术分离产物的理化常数结

3.4日内瓦毛霉培养基组成的优化

3.4.1不同葡萄糖浓度对转化率的影响:试验结果表明,当葡萄糖浓度为3.5%时,转化率最高,详见表2。

表2 葡萄糖浓度对转化率的影响(%)

3.4.2不同氮源对转化率的影响:试验结果表明,用酵母膏为氮源,转化率为最高。但由于酵母膏和蛋白胨各有优缺点:酵母膏成分复杂、价格较贵、称重时难控制,蛋白胨价格相对便宜、称重时易控制,因此该试验以蛋白胨为主要氮源,酵母膏为辅助氮源,详见表3。

表3 不同氮源对转化率的影响(%)

3.4.3蛋白胨浓度对转化率的影响:结果表明,当蛋白胨浓度1.4%时,转化率最大,详见表4。

表4 蛋白胨浓度对转化率的影响(%)

3.4.4KH2PO4浓度对转化率的影响:研究结果表明,当KH2PO4浓度为0.16%时,转化率最大,详见表5。

表5 KH2PO4浓度对转化率的影响(%)

3.4.5培养基初始pH对转化率的影响:培养基的初始pH影响产物的转化。因此,羟基化酶反应体系的pH以4.5效果最好,详见表6。

表6 初始pH对转化率的影响(%)

4 讨论

从土样中筛选到1株能转化甾体的菌株,经鉴定为日内瓦毛霉菌株。本文研究日内瓦毛霉对妊娠烯醇酮的生物转化方面进行了研究。通过利用红外和二维核磁波谱技术,确定日内瓦毛霉化学结构为7α,11α-二羟基妊娠烯醇酮和7α,11β-二羟基妊娠烯醇酮。日内瓦毛霉对妊娠烯醇酮的羟基化反应发生在C-7位上,并具有位置专一性。

同时对培养基组成进行优化研究。研究了不同碳源、氮源对妊娠烯醇酮的转化率的影响,确定葡萄糖和蛋白胨为试验最佳碳源和氮源,酵母膏为辅助氮源,单因素试验确定其含量分别为3.5%和1.4%;研究了无机盐KH2PO4不同浓度对转化率的影响,确定其浓度分别为0.16%,初始pH为4.5时,最终得到主产物转化率是:59.2%。日内瓦毛霉能够专一性地对妊娠烯醇酮经行羟基化反应,这为研究妊娠烯醇酮药物开发及体内代谢研究提供一定的理论依据。

[1]杨灿宇,杜连祥.甾体C11α-羟化菌株AF9612发酵条件的研究[J].天津轻工业学院学报,1999,23(2):45-48.

[2]Wang J,Chen CZ,Li BA,et al.Enzyme Microb Technol [J].1998,22(3):368-373.

[3]尚珂,胡海峰,朱宝泉.微生物转化法合成7α,15α-二羟基雄烯醇酮[J].中国医学生物技术应用,2004,33 (2):30-34.

[4]Phelan A,Elliott C,O'Hare P.Intercellular delivery of functional p53 by the herpesvirus protein VP22[J].Nat Biotechnol,1998,16(4):440-443.

Bio-Transformation of Pregnenolone by Mucor Genevensis

Sun Gongbing
(Heilongjiang Jinjiu Pharmaceutical Company Limited,Mishan 158300,China)

Microbial transformation of pregnenolone was studied in the Mucor genevensis culture,in which 7α,11α-dihydroxypregnenolone and 7α,11 β-dihy droxypregnenolone were given from the metabolites.The biotransformation products were determined by IR,NMR and MS analysis.The results showed that the optimal condition for the biosynthesis of 7α,11α—dihydr-roxypregnenolone was as follows:3.5%dextrose,1.4%peptone,0.16%potassium dihydydrogen phosphate,initial pH 4.5.The yield of 7α,11α-dihydroxypregnenolone was 59.2%.

Steroids;Biotransformation;Pregnenolone;Hydroxylation

R917

A学科分类代码:31047

1001-8131(2016)04-0401-03

黑龙江省农垦总局基金资助(HNK12KF-24);大庆科技局科研项目(szd201126)

2016-03-01

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