白藜芦醇对脓毒症高迁移率族蛋白B-1的影响※

罗苑苑

（广州中医药大学第一附属医院重症医学科，广东　510405）

实验研究

白藜芦醇对脓毒症高迁移率族蛋白B-1的影响※

罗苑苑

（广州中医药大学第一附属医院重症医学科，广东510405）

目的 研究白藜芦醇对脓毒症大鼠高迁移率族蛋白B-1的影响。方法 CLP术制作脓毒症大鼠模型，制备脓毒症大鼠腹腔巨噬细胞，分为对照组和白藜芦醇组，在不同时间点采用酶联免疫分析（ELISA）方法测定HMGB1浓度和实时荧光定量PCR测定HMGB1mRNA表达。结果 对照组的细胞培养上清中在术后12 h、18 h、24 h及48 h时HMGB1水平均较同时相实验组显著升高（P均＜0.05），且实时荧光定量PCR结果提示，对照组6 h的HMGB1mRNA转录水平开始增加，24 h达最高，并持续至48 h，显著高于0 h水平（P＜0.01）；而实验组HMGB1mRNA在前24 h转录开始增加，显著高于0 h水平（P＜0.01），但是24～48 h逐渐下降至0 h水平（P＞0.05）。结论 白藜芦醇可抑制脓毒症HMGB1mRNA转录水平，从而减少HMGB1水平，提示白藜芦醇可能对CLP诱导的脓毒症有一定保护效应。

白藜芦醇；脓毒症；高迁移率族蛋白B-1；动物实验

目前现代医学对脓毒症的治疗尚未取得突破性进展，如何寻找出新的更有效且副作用小的药物是医学界所面对的一个重要研究课题。因此从天然药物中寻找高效、低毒的抗脓毒症制剂是当前的研究热点之一。白藜芦醇（Resveratro1，Res）是从多年生草本植物蓼科蓼属虎杖的根茎中提取的单体，对LPS刺激小胶质细胞的COX-2和NO等炎症因子有抑制效应［1］。本研究首次以脓毒症的一种重要的晚期炎症介质高迁移率族蛋白B-1 （High mobility group box-1 protein，HMGB1）为切入点，探索具有“天然植物抗毒素”之称的白藜芦醇对脓毒症大鼠的腹腔巨噬细胞的HMGB1胞外释放是否具有明显抑制作用，为白藜芦醇治疗脓毒症提供实验依据。

1　资料与方法

1.1实验动物 8周雄性野生型 （wide type，WT）大鼠，每组30只，均由广州中医药大学动物中心提供，并统一饮食喂养，平均体重 （22.3±2.5）g。

2　方法

2.1CLP术制作脓毒症模型 用5.0%异氟烷麻醉大鼠后，将大鼠平卧位固定于动物手术台上，剔去腹部毛发，常规消毒铺巾。采用盲肠结扎穿孔术建立大鼠脓毒症模型，即沿腹正中线做一小切口，结扎盲肠根部 （避免结扎回肠及盲肠系膜血管），用18号针穿刺盲肠4次，之后将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口。然后将脓毒症大鼠分为对照组和白藜芦醇组（即实验组）。术后，单剂量的复苏液（乳酸林格氏溶液，50毫升/公斤体重）通过皮下注射给药。

2.2大鼠腹腔巨噬细胞的制备 大鼠腹腔内注入无菌巯基乙醇酸钠肉汤1 mL，造模成功后引颈处死，浸入体积分数70%乙醇中3至5 s，收集腹腔内液，1000 r/min离心5 min，去上清，用RPMI-1640培养液调整细胞数，以每平方厘米含3×105个细胞接种。细胞实验前2 h用无血清OPTI-MEMI培养液置换。

2.3培养细胞实验 将密度为3×105/m1的细胞100 μL接种于96孔板，在37℃，含有5%二氧化碳增湿的培养箱中使细胞良好贴壁，分为终浓度 1 μg/ml LPS处理组（对照组）和10 μg/ml白藜芦醇预处理30 min+终浓度1 μg/ml LPS处理组（实验组），细胞培养48 h，观察两组不同时间点细胞形态学改变，并收集细胞和细胞培养上清液，采用实时荧光定量PCR检测细胞中HMGB1mRNA表达的表达变化，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞培养上清液中HMGB1浓度的表达变化。

2.4HMGB1浓度测定 采用酶联免疫分析 （ELISA）方法。大鼠腹腔巨噬细胞培养物上清液的HMGB1测定。ELISA检测按产品使用说明书操作。试剂盒微量滴定板事先已经用纯化的HMGBI特异抗体包被，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入HMGBI抗原、生物素化的抗大鼠HMGBI多克隆抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的HMGBI呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度 （0D值），计算样品浓度。

2.5HMGB1mRNA表达检测 应用mRNA提取试剂盒，在细胞培养皿中直接裂解细胞mRNA。HMGB1引物（扩增片段为680bp）：5c-ATGGGCAAAGGAGATCCTA-3c（上游），5c-ATTCATCATCATCATCTTCT-3c（下游）。以三磷酸甘油醛脱氢酶（GADPH）作为内参对照，引物（扩增片段为309 bp）5c-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3c（上游），5c-AGATCCACAACGGATACATT-3c（下游）。HMGB1mRNA表达水平以HMGB1与GADPH基因扩增条带吸光度 （A）比值表示。

2.6统计分析 所有数据均以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用 t检验，P＜0.05有统计学差异，P＜0.01有显著性差异。所有数据应用SPSS17.0统计软件进行数据分析。

2　结果

2.1HMGB1在细胞培养上清中的含量 实验结果表明对照组于术后6 h细胞培养上清液内HMGB1水平较低，与0h相比无显著性差异，12～24 h上清液中HMGB1逐渐上升，24～48 h继续升高并维持在更高的水平，与0 h相比有显著性差异 （P＜0.01）；实验组于术后 6 h上清中HMGB1与0 h相比无显著性差异，24～48 h内上清中HMGB1逐渐上升，与0 h相比有显著性差异 （P＜0.01）；而在相同时间点，实验组上清中HMGB1含量显著低于对照组 （P＜0.01）（详见表1）。

表1　2组大鼠腹腔巨噬细胞培养物上清液的HMGB1测定

表1　2组大鼠腹腔巨噬细胞培养物上清液的HMGB1测定

注:*同组与0 h相比P＜0.01，#对照组与实验组相同时间点对比P＜0.01

组别　0 h　6 h　12 h对照组　4.41±0.81　18.41±0.80#　28.55±1.11*#实验组　4.72±0.73　7.12±0.83　9.54±1.25*18 h 44.17±4.12*#17.15±2.11*24 h　48 h 68.87±4.85*#85.56±5.52*#22.21±1.19*　31.15±2.35*

2.2HMGB1mRNA表达检测 实时荧光定量PCR结果提示，对照组6 h的HMGB1mRNA转录水平开始增加，24 h达最高，并持续至48 h，显著高于0 h水平 （P＜0.01）；实验组6 h HMGB1mRNA转录开始增加，12～18 h继续上升，显著高于0 h水平 （P＜0.01），24～48 h逐渐下降至0 h水平 （P＞0.05）；在相同的时间点，实验组8～48 h后HMGB1mRNA转录水平显著低于对照组 （P＜0.01）（详见表2）。

表2　2组大鼠腹腔巨噬细胞细胞HMGB1mRNA表达

表2　2组大鼠腹腔巨噬细胞细胞HMGB1mRNA表达

注:*同组与0 h相比P＜0.01，#对照组与实验组相同时间点对比P＜0.01

组别　0 h　6 h　12 h对照组　1　5.11±0.72#　7.15±0.84*#实验组　1　2.51±0.55　4.14±0.56*18 h 12.51±1.25*#3.31±0.31*24 h　48 h 18.51±2.55*#10.85±1.22*#3.55±0.41*　1.15±0.25*

3　讨论

脓毒症发生发展的根本原因在于机体过度释放TNF-α、IL-6、HMGB1等炎性细胞因子，导致炎症反应失控和免疫功能失调。早期炎症因子 TNF-α、IL-6和晚期释放的HMGB1相互促进，形成炎症细胞因子风暴，最终引发致死性的脓毒性休克和MODS发生［2］。因此，治疗脓毒症的关键是能否有效抑制炎症细胞因子释放、相互促进的网络，阻断炎症级联反应扩大。LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞可诱导其释放TNF-α、IL-6等早期炎症因子和 HMGB1，释放到胞外的HMGBl，引起 TNF-α、IL-6等多种炎性细胞因子的再次释放以扩大炎症反应。HMGBl一旦进入组织间隙，即可表现出其炎症因子的作用:通过自身毒性作用、刺激其他促炎因子释放、导致凝血、纤溶系统功能紊乱、破坏血管内皮细胞的完整性、扰乱免疫系统功能、破坏肠黏膜屏障的完整性等多种途径参与或加重脓毒症的致病过程［3-4］。故高迁移率族蛋白在脓毒症的致死过程中发挥着关键性炎性因子作用。研究表明，即使在致病因素作用后24 h使用抗HMGBl抗体、HMGBl的A盒或丙酮酸等针对HMGBl进行处理，均可显著提高脓毒症动物的生存率［5］。正是由于HMGBl延迟合成与分泌的特点及其广泛的致病作用，HMGBl相较于早期炎症因子，HMGB1出现晚、持续时间更长，能给脓毒症的治疗提供更广的时间窗，被认为是脓毒症致病的关键性因子，并可能为脓毒症的治疗带来新的突破［7］。

白藜芦醇 （Resveratrol，Res）属于一种酚类植物抗毒素，是天然的抗氧化物和自由基清除剂，主要存在于各种红葡萄果实和红葡萄酒中。自然界中的葡萄皮、花生及中药虎杖等72种植物均含有不同量的天然白藜芦醇，在恶劣环境或是在这些植物受到霉菌感染时会产生白藜芦醇，因而它亦是一种植物抗毒素。白藜芦醇最初作为一种葡萄属植物抗毒素被发现，目前因具有可靠而广泛的抗炎作用而日益受到人们的重视［8］。虽然大量细胞和动物研究报道白藜芦醇的抗炎作用，但是还未见白藜芦醇针对脓毒症治疗方面的报道。本研究旨在探讨白藜芦醇干预对CLP诱导的脓毒症大鼠高迁移率族蛋白B1表达的影响，以期为中药防治脓毒症提供依据。本研究显示，对照组的细胞培养上清中在术后12 h、18 h、24 h及48 h时HMGB1水平均较同时相实验组显著升高（P均＜0.05），且实时荧光定量PCR结果提示，对照组6 h的HMGB1mRNA转录水平开始增加，24 h达最高，并持续至48 h，显著高于0 h水平 （P＜0.01）；而实验组HMGB1mRNA在前24 h转录开始增加，显著高于0 h水平 （P＜0.01），但是24～48 h逐渐下降至0 h水平 （P＞0.05），说明白藜芦醇可抑制脓毒症HMGB1mRNA转录水平，从而减少HMGB1水平，表明白藜芦醇可能对CLP诱导的脓毒症有一定保护效应，但白藜芦醇对HMGB1下游炎症因子释放有无抑制作用尚有待进一步研究。

［1］Kim YA，Kim GY，Park KYJ.Resveratrol inhibits nitric oxide and prostaglandin E2 production by lipopolysaccharide-activated C6microglia［J］. Med Food，2007，10（2）:218-224.

［2］Sun R，ZhangY，LvQ，et al:Toll-like receptor 3（TLR3）induces apoptosis via death receptors and mitochondria by up-regulating the transactivating p63 isoformalpha（tap63alpha）.J Biol Chem2011；286:15918-15928

［3］Coulthard LR，White DE，Jones DL，et al.p38（MAPK）:stress responses from molecular mechanisms to therapeutics［J］.Trends Mol Med，2009，15（8）:369-379.

［4］Baker RG，Hayden MS，Ghosh S.NF-κB，inflammation，and metabolic disease［J］.Cell Metab，2011，13（1）:11-22.

［5］Kim ID，Lim CM，Kim JB，et al.Neuroprotection by biodegradable PAMAM ester（e-PAM-R）-mediated HMGB1 siRNA deliveryin primarycortical cultures and in the postischemic brain［J］.J Control Release.2010，142（3）:422-430.

［6］Tavil B，Aytac S，Balc YI，et al.Fludarabine，cytarabine，granulocyte，colony stimulating factor，and idarrbicin（FLAGIDA）for the treatment of children with poor-prognosis acute leukemia:the Hacettepe experience［J］.Pediatr Hematol Oncol，2010，27（7）:517-528

［7］李金，白杨，张亚历.白藜芦醇对脂多糖激活RAW264.7细胞MAPK炎症通路的影［J］.山东医药，2010，50（23）:49-50.

Effect of Resveratrol on Septic of High Mobility Group Protein B-1

LUO Yuanyuan
（ICU of the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

Objective To study the effect of resveratrol on septic of high mobility group protein B-1.Methods Sepsis rat models were made by CLP.Macrophages，which were prepared from rat peritoneal，were divided into control group and resveratrol group.At different time points，the concentration of HMGB1 was determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），and HMGB1mRNA expression was determined by real-time fluorescence quantitative PCR.Results At 12 h，18 h，24h and 48h after surgery，the levels of HMGB1 in the control group were significantly higher than those in the experimental group（P＜0.05），and real-time PCR results suggested that the HMGB1mRNA transcription level of the control group increased at 6h，reached the highest at 24h，and lasted to 48h，which was significantly higher than that at 0h（P＜0.01）.In the experimental group，HMGB1mRNA transcription increased at the first 24 hours，which was significantly higher than the level as 0 hours（P＜0.01），but gradually decreased to the level of 0h in 24-48h（P＞0.05）.Conclusion Resveratrol can inhibit septic HMGB1mRNA transcriptional level，and reduce the level of HMGB1，which suggested that resveratrol may have some protective effect on CLP induced sepsis.

resveratrol；sepsis；high mobility group protein B-1；animal experiment

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.13.059

1672-2779（2016）-13-0128-03

广东省中医药局科研课题（No:20141118）

（本文编辑:李海燕 本文校对:温敏勇2015-12-15）