Rag1、Rag2 基因缺陷小鼠的构建及在异种肿瘤移植中的应用

沈如凌， 石嘉豪， 盛哲津， 冯晓龙， 吴文婷， 费 俭（.同济大学生命科学与技术学院， 上海 0009； .上海南方模式生物研究中心， 上海 00）

Rag1、Rag2 基因缺陷小鼠的构建及在异种肿瘤移植中的应用

沈如凌1，2， 石嘉豪1， 盛哲津1， 冯晓龙2， 吴文婷2， 费 俭1，2
（1.同济大学生命科学与技术学院， 上海 200092； 2.上海南方模式生物研究中心， 上海 201210）

目的 建立重组激活基因， Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型，并对其表型和异种肿瘤移植的成瘤性进行分析。方法 通过传统的胚胎干细胞（ES）细胞打靶、囊胚注射方式，分别构建Rag1 和Rag2基因缺陷小鼠模型； 通过流式细胞术对缺陷小鼠外周血T/B淋巴细胞含量进行检测； 通过外源异种肿瘤细胞移植实验，对移植肿瘤细胞的成瘤性进行评价。结果 建立了Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型， 两种基因突变纯合子小鼠模型外周血中T、B淋巴细胞含量较野生型小鼠显著降低； 人源肿瘤细胞A549在上述两种基因突变纯合子小鼠中较BALB/c-nu （裸小鼠）或（NOD-SCID）非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠表现出更强的成瘤性。结论 分别成功建立了Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型，两种小鼠模型均发生了T、B淋巴细胞生成障碍，导致免疫系统严重缺陷，可作为异种外源肿瘤移植的受体，用于小鼠荷瘤模型的建立。

重组激活基因（Rag1基因）； Rag2基因； 基因缺陷； 免疫缺陷

重组激活基因（recombination-activating genes，Rags）在V（D）J重组过程中发挥重要作用［1］， V（D）J重组过程中发生的免疫球蛋白（Ig）基因和T细胞受体（TCR）基因的重排和重组是B细胞和T淋巴细胞成熟过程中的必需阶段。小鼠的两个重组激活基因Rag1和Rag2均位于2号染色体，其编码的Rag1和Rag2蛋白在成熟前T细胞发育成为成熟T细胞以及成熟前B细胞发育成为成熟B细胞的过程中，通过识别Ig或TCR基因，并结合基因片段中的重组信号序列（RSS），启动V（D）J重组［2-4］。Rag1和Rag2在淋巴细胞V（D）J重排过程中缺一不可［5，6］，任意一个缺失都会导致T、B淋巴细胞发育中断，表现为严重的T/B细胞早期发育阻滞，T细胞停滞在CD3-CD4-CD8-CD25+阶段［7］，B细胞停滞在B220-CD43+IgM-阶段［8，9］，进而不能产生成熟的T、B淋巴细胞。因外周血中没有成熟T/B淋巴细胞，导致机体产生与人“重症联合免疫缺陷症”（severe combined immunodeficiency， SCID）类似的症状［10］。

Rag1或者Rag2基因缺陷的小鼠外观发育正常，具有正常生殖能力，但由于不能产生T、B淋巴细胞［11，12］，无法对异体来源的细胞产生异体排斥， 因而可以作为移植瘤模型的载体［13，14］。目前常用的小鼠荷瘤模型实验动物主要包括BALB/c裸小鼠和SCID小鼠系列［14］。美国Jackson Lab实验室已有缺失Rag1或Rag2基因的纯合子小鼠提供［14］，但国内并没有构建该品系小鼠的报道及相关产品供应，也没有对该小鼠的成瘤性进行过评价。本实验室利用基因工程的方法构建了C57BL/6J×129S1背景的Rag1基因突变纯合子小鼠（Rag1-/-）和Rag2基因突变纯合子小鼠（Rag2-/-），并验证了两种小鼠模型的T/B细胞缺失情况以及人源肿瘤细胞在这两种小鼠上的成瘤效果，从而证明本实验室构建的Rag1和Rag2基因突变纯合子小鼠与已报道的其他Rag1和Rag2基因敲除小鼠模型［11，12］具有相同的表型，与其他常用小鼠荷瘤模型一样，可以作为荷瘤模型受体应用于肿瘤学、免疫学、药品与生物制品的安全性评价及药物筛选等领域中，也为国内的科研工作者提供了更多的品系选择。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞

C57BL/6J小鼠由上海南方模式生物科技发展有限公司提供［SCXK（沪） 2014-0002］； BALB/c裸小鼠和NOD-SCID小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司［SCXK（沪）2012-0002］。ES细胞来源于C57BL/6J ×129S1小鼠，由上海南方模式生物科技发展有限公司建系并保存，非小细胞肺癌A549细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

1.2 质粒和菌株

含Rag1和Rag2基因的细菌人工染色体（BAC）（129小鼠品系）购于Source Bioscience Ltd.， BAC号分别为： bMQ176c08和bMQ176c08； 质粒PL-451、PL-452，菌株EL-350由Liu Pengtao（英国剑桥Wellcome Trust Sanger Institute）惠赠。pSC101-BAD-γβα-A-tet由张友明（德国Gene Bridges GmbH）惠赠。D-H5α为博大泰克产品。pBR322-MK为上海南方模式生物科技发展有限公司改建。

1.3 主要试剂

胚胎干细胞（ES）细胞培养所需的DMEM培养基（高糖， ES细胞级）、胎牛血清（ES细胞级）、G418、更昔洛韦、LIF、青链霉素、胰蛋白酶等分别购自Gibco BRL公司（美国）、Sigma公司（美国）、Chemicon公司（美国）； A549细胞培养所用F12 NUTRIENT MIX-KAIGHNS MOD培养基和胎牛血清购自Invitrogen公司（美国）； PBS和叠氮钠购自碧云天（中国）， APC标记大鼠抗小鼠CD19和PE标记大鼠抗小鼠CD3e购自BD pharmagen （美国）； 各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、T4 DNA polymerase、Taq酶及PCR相关试剂购自TaKaRa公司（日本）； L-阿拉伯糖、盐酸、四环素等常规化学试剂主要购自Sigma （美国）和上海化学试剂公司（中国）； DNA凝胶回收Kit购自索莱宝科技有限公司（中国）。

1.4 小鼠模型构建

运用ET克隆的方法构建Rag1和Rag2定点敲入打靶载体。大致过程如下： 以BAC为模板扩增获得Retrieve， 用小同源臂A、B、C、D臂， 将A臂和B臂克隆至pBR322-2S质粒的HindIII & KpnI酶切位点， 获得Retrieve质粒， 利用该质粒和BAC克隆，通过细菌内同源重组方式，获得A区域到B区域之间包含有5'和3'同源臂的DNA片段的质粒； 将loxp-EGFP-PolyA-loxp序列克隆至PL451的EcoRV位点，将C同源臂克隆至loxp-EGFP-PolyA-loxp序列的上游，将D同源臂克隆至FRT-Neo-FRT下游位点，该质粒经KpnI/NotI双酶切后，分离获得含C-loxp-EGFP-PolyA-loxp-FRT-Neo-FRT-loxp-D片断，然后经过细菌内同源重组敲入到上述获得的Retrieve质粒中，分别构建获得打靶载体pBR322-MK-Rag1和pBR322-MK-Rag2，并经酶切和测序验证正确。打靶载体经线性化后通过电转转入ES细胞，通过G418和更昔洛韦抗性筛选获得抗性克隆，抗性克隆经过PCR鉴定及测序确认获得重组阳性ES细胞克隆。Rag1 敲入阳性ES细胞克隆鉴定策略及4条PCR鉴定引物I， II， III， IV位置如图1箭形标记所示，序列分别为：

P1： 5'-TGCAACTGTGCGTTTCTTTC-3'；

P2： 5'-AAGTCGTGCTGCTTCATGTG-3'；

P3： 5'-TCGCCTTCTTGACGAGTTCT-3'；

P4： 5'-CGAAACGCTGTGAGTTGAAA-3'。

Rag2敲入阳性ES细胞克隆鉴定策略及4条PCR鉴定引物I， II， III， IV位置如图2箭形标记所示，序列分别为：

P1： 5'-CCATGGGCGTACTTGCTATT-3'；

P2： 5'-GAACTTCAGGGTCAGCTTGC-3'；

P3： 5'-TCGCCTTCTTGACGAGTTCT-3'；

P4： 5'-GGGGTGAACCATTGATTTTG-3'。

将ES细胞扩增后， 经囊胚注射到C57BL/6J小鼠囊胚中发育获得嵌合鼠， 嵌合鼠与C57BL/6J野生型小鼠交配， 分别获得稳定遗传的Rag1和Rag2敲入小鼠。Rag1和Rag2小鼠模型构建完成后，通过杂合子交配分别获得Rag1、Rag2基因缺陷纯合子小鼠模型。Rag1基因缺陷小鼠基因型鉴定引物序列为：

P1： 5'-GCGATACGCTATTGATACTTT-3'；

P2： 5'-TTGTACTCCAGCTTGTGCC-3'；

P3： 5'-GCTCGTTGAGTCAGAATTGAG-3'。

野生型条带大小为344 bp，Rag1基因缺陷阳性条带大小为593 bp。Rag2基因缺陷小鼠基因型鉴定引物序列为：

P1： 5'-TCAAAGCAAAGCCAGTCCG-3'；

P2： 5'-TAGGTCAGGGTGGTCACGAGGG-3'；

P3： 5'-GACCCACTGTTACCATCTGC-3'。野生型条带大小为267 bp，Rag2基因缺陷阳性条带大小为485 bp。

1.5 外周血淋巴细胞流式细胞术（FACS）检测

小鼠经异氟烷麻醉， 眼球取血， 血样加入等体积质量分数0.9%NaCl稀释； 血样平铺至淋巴细胞分离液面上， 离心取分离液层， 去除红细胞后， PBS洗涤2次。将细胞重悬于染色缓冲液中（PBS+2%FBS +0.1% NaN3）， 荧光抗体［抗CD3e（PE标记）， 抗CD19 （APC标记）］对小鼠外周血淋巴细胞进行标记， 冰上避光孵育20 min， 染色缓冲液洗涤2次后按常规方法上流式细胞仪FACS Calibur（BD）检测， CellQuest软件分析样品。每个样品检测收集10 000个细胞。

1.6 细胞培养

非小细胞肺癌A549细胞培养于含体积分数10%胎牛血清（青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL）F12 NUTRIENT MIX- KAIGHNS MOD培养基中，待培养至一定数量后收集备用。

1.7 荷瘤小鼠模型建立

Rag1-/-小鼠，Rag2-/-小鼠，BALB/c裸小鼠，NOD-SCID小鼠和C57BL/6J小鼠，饲养于SPF级动物设施［SYXK（沪2012-002］， 每组各7只。收集对数生长期A549细胞， 将细胞浓度调整为5×107/mL，取100 μL接种于小鼠后腿右侧皮下。接种当日记为第0日，每日观察接种部位肿瘤生长情况，待观察到肿瘤生长，每周2次用游标卡尺测量肿瘤长径（D）和短径（d），按照肿瘤体积V=（D×d2）/2计算肿瘤体积， 当小鼠肿瘤长至1 000 mm3时停止测量。

1.8 肿瘤组织病理学观察

取小鼠皮下肿瘤部分组织固定于质量分数4%中性甲醛溶液中，常规石蜡包埋、脱水、切片、HE染色后，镜下观察。

1.9 数据统计分析

数据结果用GraphPad Prism6.0软件进行统计分析，数据以x-± s表示，使用t检验方法统计并作图，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Rag1和Rag2基因缺陷小鼠构建

Rag1基因缺陷小鼠的构建策略如图1A所示，通过ES细胞打靶同源重组的方式将loxp-EGFP-polyA-loxp-FRT-PGK-Neo-polyA-FRT-loxp片段定点插入到Rag1基因蛋白翻译起始密码子ATG的AT碱基之后。该片段的插入将破坏內源Rag1基因的正常转录和蛋白翻译，造成Rag1基因功能性缺失。构建的Rag1同源重组载体经线性化、ES细胞打靶和药物压力筛选后共获得165个抗性克隆； 经PCR鉴定，共获得5个正确同源重组的ES细胞克隆。ES细胞阳性克隆PCR鉴定策略和引物位置如图1A所示； 5'和3'同源臂正确重组阳性克隆PCR鉴定结果代表性电泳图如图1B和C所示， 5'同源臂重组阳性克隆扩增获得4.3 kb PCR产物条带，阴性克隆无PCR产物； 3'同源臂重组阳性克隆扩增获得3.2 kb PCR产物条带，阴性克隆无PCR产物。通过ES细胞的囊胚注射和胚胎移植，2个阳性ES细胞克隆共注射40枚胚胎， 制作4只受体，获得8只高度嵌合雄鼠。嵌合体雄鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，共获得ES细胞来源的F1代小鼠14只，经PCR鉴定其中7只为阳性杂合子小鼠，阳性杂合子小鼠5' 和3'同源臂PCR鉴定策略同ES细胞同源重组阳性克隆鉴定策略， 鉴定代表图如图1D和E所示。Rag1基因缺陷杂合子小鼠经自交获得Rag1基因缺陷纯合子小鼠（Rag1-/-）， 小鼠基因型PCR鉴定电泳代表图如图1F所示（纯合子小鼠PCR扩增获得一条593 bp条带； 杂合子小鼠PCR扩增获得593 bp和344 bp两条带； 野生型小鼠PCR扩增获得344 bp一条带）。

Rag2基因缺陷小鼠的构建策略如图2A所示，通过ES细胞打靶同源重组的方式将loxp-EGFP-polyA-loxp-FRT-PGK-Neo-polyA-FRT-loxp片段定点插入到Rag2基因exon3蛋白翻译起始密码子ATG前10个碱基处。该片段的插入将破坏內源Rag2基因的正常转录和蛋白翻译，造成Rag2基因功能性缺失。构建的Rag2同源重组载体经线性化、ES细胞打靶和药物压力筛选后共获得165个抗性克隆；经PCR鉴定，共获得10个正确同源重组的ES细胞克隆。ES细胞阳性克隆PCR鉴定策略和引物位置，如图2A所示；5'和3'同源臂正确重组阳性克隆PCR鉴定结果代表性电泳图如图2B和2C所示，5'同源臂重组阳性克隆扩增获得4.3 kb PCR产物条带，阴性克隆无PCR产物； 3'同源臂重组阳性克隆扩增获得3.4 kb PCR产物条带，阴性克隆无PCR产物。通过ES细胞的囊胚注射和胚胎移植，2个阳性ES细胞克隆共注射168枚胚胎，制作14只受体， 获得7只高度嵌合雄鼠。嵌合体雄鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，共获得ES细胞来源的F1代小鼠33只，经PCR鉴定其中13只为阳性杂合子小鼠，阳性杂合子小鼠5'和3'同源臂PCR鉴定策略同ES细胞同源重组阳性克隆鉴定策略，鉴定代表图如图2D和2E所示。Rag2基因缺陷杂合子小鼠经自交获得Rag2基因缺陷纯合子小鼠（Rag2-/-）， 小鼠基因型PCR鉴定电泳代表图如图2F所示（纯合子小鼠PCR扩增获得一条485 bp条带； 杂合子小鼠PCR扩增获得485 bp和267 bp两条带； 野生型小鼠PCR扩增获得267 bp一条带）。

2.2 Rag1、Rag2基因缺失导致小鼠成熟T、B淋巴细胞缺失

通过流式细胞术对野生型C57BL/6J小鼠、NOD-SCID小鼠、Rag1-/-小鼠和Rag2-/-小鼠外周血中B细胞和T细胞的检测结果表明： Rag1-/-小鼠和Rag2-/-小鼠中的T细胞和B细胞含量较野生型小鼠有显著性降低（P＜0.0001， 图3B）， T细胞和B细胞含量分别约为野生型的5%和25%； 较NOD-SCID小鼠虽然均值略有增高， 但无显著性差异（P＞0.05， 图3B）。

2.3 Rag1、Rag2基因缺失小鼠可作为异源移植肿瘤受体

图1 Rag1基因缺陷小鼠构建策略及鉴定结果

图2 Rag2基因缺陷小鼠构建策略及鉴定结果

图3 4种小鼠外周血功能T、B淋巴细胞含量流式细胞术检测结果

将异源肿瘤细胞分别移植到Rag1-/-小鼠、Rag2-/-小鼠、NOD-SCID小鼠、BALB/c裸小鼠和野生型C57BL/6J小鼠上， 观察和比较肿瘤细胞移植后的生长。结果显示， 在Rag1-/-和Rag2-/-背景小鼠上，移植肿瘤生长速度最快，且两者之间无显著性差异； 在NOD-SCID背景小鼠上的肿瘤生长速度次之； 然后是在BALB/c裸小鼠背景； 而在C57BL/6J小鼠上则无肿瘤生成（图4A）。Rag1-/-和Rag2-/-小鼠上的肿瘤， 自肿瘤移植22 d后，显著大于BALB/c裸小鼠和NOD-SCID小鼠上的肿瘤体积（图4A）。

肿瘤组织切片的HE染色结果显示， 来自Rag1-/-和Rag2-/-小鼠上的移植肿瘤组织和其他品系小鼠上的移植肿瘤组织切片没有显著差异，各组小鼠肿瘤细胞均生长旺盛，肿瘤细胞大小不一，胞核形态比较类似，可见瘤组织均呈巢状或片状生长，细胞间微血管较丰富（图4B）。

这些结果表明，Rag1-/-和Rag2-/-小鼠相较于传统的异源肿瘤移植受体小鼠品系BALB/c Nu裸小鼠和NOD-SCID小鼠，肿瘤生长速度更快。

图4 不同背景小鼠接种A549肿瘤细胞成瘤性结果

3 讨论

本实验室通过基因工程改造的方法，分别获得了C57BL/6J×129S1背景的Rag1基因缺失和Rag2基因缺失小鼠； 后续的表型分析结果显示，Rag1或Rag2基因缺失纯合子小鼠外周血中T细胞和B细胞显著降低， 与已有文献［11，12］报道一致； 外周血中T细胞和B细胞的含量与市场上销售的NOD-SCID小鼠相类似（图3）， 这也从另一方面验证了Rag1和Rag2基因缺失小鼠确实发生了Rag1和Rag2的功能缺失。

在本研究中，通过接种人源肿瘤细胞株A549细胞，表明A549细胞可以在作者构建的Rag1和Rag2基因缺失小鼠皮下成瘤，且生长速度快于对照的NOD-SCID和BALB/c裸小鼠（图4）。这说明，与文献报道一致［14］，作者构建的Rag1和Rag2基因缺失小鼠可以作为外源肿瘤移植的受体，而且对于A549细胞而言， 两种基因缺陷小鼠比较NOD-SCID和BALB/c裸小鼠具有更好的成瘤效果。此外，作者也在Rag1-/-和Rag2-/-小鼠中尝试移植了病人来源的肝癌肿瘤组织块，结果显示移植肿瘤组织块也可以在Rag1-/-小鼠和Rag2-/-小鼠上生长成瘤（数据未显示），这均表明了这两种品系小鼠作为外源肿瘤移植受体具有良好的成瘤性。

在设计策略上， Rag1基因缺陷小鼠是将loxp-EGFP-PolyA-loxp序列定点插入到了翻译起始密码子ATG的AT碱基之后，AT-loxp-EGFP形成了一个完整的EGFP融合蛋白表达框； Rag2基因缺陷小鼠是将loxp-EGFP-PolyA-loxp序列定点插入到了翻译起始密码子ATG上游10 bp位置。两个小鼠的设计策略，EGFP的表达均受内源性Rag1和Rag2基因启动子的驱动，因此可通过EGFP的荧光表达，用于对Rag1和Rag2基因的表达部位和表达强度进行示踪。同时，EGFP-polyA元件两端loxp位点的添加，使得Cre作用后还可以恢复原来缺失的Rag1和Rag2基因的表达，因此这两种小鼠模型和淋巴细胞特异性Cre或者Cre/ERT2小鼠配合使用， 可用于时空特异性观察Rag1和Rag2缺失后恢复对淋巴细胞发育以及功能的影响。值得关注的是， Rag1、Rag2基因缺陷小鼠因免疫系统缺陷， 近年来也被用于构建人源化肝脏小鼠模型［15］， 制备病毒感染小鼠模型［16］和研究肠道菌群［17］等方面。作者的后续研究，将对该模型小鼠在这些方面的应用作进一步探讨。

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Generation of Rag1 and Rag2 Deficient Mice and Their Application in Tumor Xenograft

SHEN Ru-ling1，2， SHI Jia-hao1， SHENG Zhe-jin1， FENG Xiao-long2， WU Wen-ting2， FEI Jian1，2
（1.School of Life Science and Technology， Tongji University， Shanghai 200092， China；
2.Shanghai Research Center for Model Organisms， Shanghai 201210， China）

Objective To establish recombination-activating genes， Rag1， Rag2 deficiency mouse models and study the possibility as tumor xenograft recipients.Methods The traditional embryonic stem （ES） cell targeting and blastocyst microinjection were performed to develop the Rag1 and Rag2 deficiency mouse models.The flow cytometry assay was conducted to analyze the T/B lymphocyte contents in peripheral blood.The tumorigenicity on different immunodeficiency mouse strains was assessed by exogenous tumor cell transplantation experiment.Results Rag1 and Rag2 deficiency mouse models were established.The T/B lymphocytes of peripheral blood in two strains of homozygous mutant mouse models were significantly reduced compared with those of wild type mice.A549 tumor cells had stronger tumorigenicity in Rag1， Rag2 mutant mice than that in BALB/c nude mice and NODSCID mice.Conclusion Rag1， Rag2 deficiency mouse models were successfully developed.Two mouse models display serious immune system defects， which could be used as exogenous tumor transplant recipients to establish tumor model.

Recombination-activating genes （Rag1 gene）； Rag2 gene； Gene defect； Immunodeficiency

Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0263-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.004

2016-03-10

上海市科委科研计划项目（14431904600，13DZ2280600）

沈如凌（1981-）， 女， 助理研究员， 研究方向： 肿瘤学。E-mail： alieen_shen@163.com

费俭， 男， 教授， 研究方向： 基因功能的模式生物研究。E-mail： jfei124@126.com