几种常用防腐剂对日化产品中腐败微生物抑制效果研究

杨　娟，　刘永龙，　林　芮，　梁　健，　陈　娟，　黄小茉,3，　邱晓颖,3*

1.广东迪美生物技术有限公司，广州 510663； 2.广东省防霉抗菌工程技术研究中心，广州 510070；3.广东省微生物研究所 省部共建华南应用微生物国家重点实验室 广东省菌种保藏与应用重点实验室，广州 510070



几种常用防腐剂对日化产品中腐败微生物抑制效果研究

杨娟1,2，刘永龙1,2，林芮1,2，梁健1,2，陈娟1,2，黄小茉1,2,3，邱晓颖1,2,3*

1.广东迪美生物技术有限公司，广州 510663； 2.广东省防霉抗菌工程技术研究中心，广州 510070；3.广东省微生物研究所 省部共建华南应用微生物国家重点实验室 广东省菌种保藏与应用重点实验室，广州 510070

了解几种常用防腐剂在日化产品基质中的防腐效果。采用最低抑菌浓度方法测试卡松、对羟基苯甲酸甲酯、苯氧乙醇、咪唑烷基脲、苯甲醇对腐败微生物的抑菌活性；采用微生物挑战性实验验证卡松、对羟基苯甲酸甲酯、咪唑烷基脲、苯氧乙醇和苯甲醇的抑菌效果。日化产品中分离的腐败微生物对卡松耐受性接近0.0015%，接近《化妆品卫生规范》2007版的限定，其它4种防腐剂在规定的使用范围内对分离的微生物都具有较好的抑制效果；卡松剂量在0.0015%、对羟基苯甲酸甲酯剂量在0.2%、咪唑烷基脲剂量在0.075%、苯甲醇剂量在0.2%时日化产品能通过微生物挑战。日化企业应根据实际情况筛选、复配防腐剂，建立更加高效、经济的防腐体系。

防腐剂； 最低抑菌浓度； 微生物挑战实验

日化产品指的是人们日常生活中使用的科技化学品，包括洗发水、沐浴露、化妆品等，随着人们对日化产品的需求不断提高，越来越多的生物原料被添加到日化产品中，在改善产品功能的同时，更增加了产品被微生物污染的机会[1-3]。近年来国内外关于市售日化用品微生物污染状况调查研究表明，微生物指标不合格的产品仍然占有一定比例[4-6]。2015年本团队共检测了37家不同公司的2 037件日化产品，其中被微生物污染的共有179件，经过分离鉴定，发现在变质产品中检出率最高的微生物为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaerugimosa)；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；微杆菌(Microbacteriumsp.)；洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)；黑曲霉(Aspergillusniger)；绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)等。

为了保障日化用品品质安全，添加防腐剂成为抑制微生物污染的主要手段，但防腐剂添加量过少，易诱导细菌产生耐药性，添加量过多，会对人体安全产生影响[7,8]，防腐剂的防腐效果评价是日化用品研发中的一个重要环节。我国一些机构的统计及美国FDA对防腐剂使用情况公布表明，日化用品的常用防腐剂主要有对羟基苯甲酸酯类(后文简称甲酯)、苯氧乙醇、甲基异噻唑啉酮(后文简称卡松)、咪唑烷基脲、苯甲醇等[9]。本研究采用最低抑菌浓度(MIC)和微生物防腐挑战实验评估这几种防腐剂对日化产品中常见的腐败微生物的防腐效果，选择出使用量低且能够有效抑制微生物生长的防腐剂，为日化企业选择防腐剂提供依据。

1　材料与方法

1.1材料

由某日化企业提供的未添加任何防腐剂的洗发水基质。

1.2培养基

卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。生化试验培养基参见《微生物培养基的制造与应用》[10]。

1.3防腐剂

卡松、甲酯、苯氧乙醇、咪唑烷基脲、苯甲醇，由广东迪美生物技术有限公司提供。

1.4实验菌株

从变质样品中分离并鉴定的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaerugimosa) JZK-055(洗发水)；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JZK-064(沐浴露)；微杆菌(Microbacteriumsp.)JZK-137(洗手液)；洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)JZK-105(洗洁精)；黑曲霉(Aspergillusniger)JZK-110(面霜)；绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)JZK-133(面膜)。

1.5实验方法

1.5.1霉菌孢子悬液和细菌悬液的配制[11]

将黑曲霉和绳状青霉从甘油管中分别接种到PDA平板，置于恒温培养箱中28 ℃培养7 d。培养好后用灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱孢子，并稀释至5×106CFU/mL (血球计数板计数)备用。将1.4中细菌分别从甘油管中接种到卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基, 置于摇床上 37 ℃ 振荡培养12 h，取菌液1 mL, 离心弃上清, PBS各洗涤1次, 并用PBS分别稀释至5×107CFU/mL (测OD600)备用。

1.5.2不同防腐剂对腐败微生物的MIC研究

以无菌操作用PBS分别将卡松稀释成质量百分浓度为0.4%、0.3%、0.2%、0.15%和0.1%；甲酯浓度为20%、10%、5%、2%和1%；苯氧乙醇为40%、30%、20%、10%和5%；咪唑烷基脲浓度为10%、7.5%、5%、2.5%和1%；苯甲醇40%、30%、20%、10%和5%的稀释液。制备100 mL的卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基和PDA培养基，将防腐剂按1%接种量加入培养基，制备成相应浓度的培养基：卡松浓度为(μg/mL)40、30、20、15和10；甲酯浓度为(μg/mL)2 000、1 000、500、200和100；苯氧乙醇浓度为(μg/mL)4 000、3 000、2 000、1 000和500；咪唑烷基脲浓度为(μg/mL)1 000、750、500、250和100；苯甲醇浓度为(μg/mL)4 000、3 000、2 000、1 000和500。分别倾注平皿。将制备的5×107CFU/mL菌悬液取100 μL于含防腐剂的培养基上，以同种浓度的菌悬液接种到不含防腐剂的培养基上做空白对照。

1.5.3化妆品中添加不同防腐剂的微生物挑战实验

本次实验参考化妆品、 盥洗用品与香料协会(CTFA) 及美国药典的微生物挑战性实验方法[12,13]。即将从变质日化用品中分离的霉菌混合后稀释到5×106CFU/mL，分离的细菌混合后稀释到5×107CFU/mL，分别取100 μL接种到50 g化妆品中，在第3 d、7 d、14 d、21 d和28 d用平板计数法检测微生物的存活状态。当细菌在七天之内至少减少99.9%，并且测试7d～28 d内没有增加；霉菌在7 d之内应该至少减少90%，并且测试7 d～28 d内没有增加判定为挑战通过。

2　结果与讨论

2.15种防腐剂对日化产品中分离微生物的最低抑制浓度

卡松、甲酯、咪唑烷基脲、苯氧乙醇、苯甲醇是目前国内外日化企业使用最为广泛的几类防腐剂。《化妆品卫生规范》2007版中规定对羟基苯甲酸酯的最大允许使用浓度为：混合酯0.8%，单酯0.4%；卡松的最大允许使用浓度为0.0015%；咪唑烷基脲的最大允许使用浓度为0.6%；苯氧乙醇和苯甲醇的的最大允许使用浓度为1%。

本实验采用微生物学琼脂稀释法进行了需氧菌药敏性最低抑制浓度测试。

表1　5种防腐剂对腐败微生物的最低抑制浓度(μg/mL)

结果显示，本实验从变质样品中分离的微生物对卡松的耐受性都比较高，接近或者超出了使用限量，可能是污染的微生物对卡松产生了耐受性。此外由于卡松含有氯离子，具有一定刺激性，国内外对它在日化用品中的使用限制越来越严格，卡松的安全性和其在日化产品中的使用情况需要进一步关注[14，15]，另外4种防腐剂在规定的使用范围内对分离的微生物都具有较好的抑制效果。同时这几类防腐剂对真菌的抑制效果要优于细菌。

不同微生物对不同防腐剂的敏感性差异较大，日化企业在挑选防腐剂时应根据配方的要求和风险微生物状况通过实验合理选择，这对于日化产品微生物污染的预防，常用防腐剂的选择具有重要意义。

2.2日化产品中添加不同防腐剂的微生物挑战实验

日化企业投产前对产品防腐体系的可靠性做效能测试是十分必要的，目前，国内外配方设计时普遍采用防腐挑战性试验评价防腐剂的有效性。通过微生物挑战性实验方法可以为企业选择既能有效抑菌，又能达到最低添加量实现产品安全的防腐剂时提供参考。本次实验参考化妆品、盥洗用品与香料协会(CTFA)及美国药典的微生物挑战性实验方法，结果见表2。

表2　防腐剂对日化产品中分离细菌的挑战性实验(CFU/mL)

*细菌混合液：铜绿假单胞菌(Pseudomonasaerugimosa)；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；微杆菌(Microbacteriumsp)；洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia).

同一防腐剂对不同微生物有不同的MIC。配方设计时第一步会考虑MIC较小的防腐剂。本实验根据5种防腐剂的MIC结果设计了3种剂量的微生物挑战性实验，结果显示，5种防腐剂对霉菌抑制效果较好，都通过了霉菌混合液的挑战实验；但仅卡松剂量在0.0015%、甲酯剂量在0.2%、咪唑烷基脲剂量在0.075%、苯甲醇剂量在0.2%时能通过细菌混合菌液的挑战实验；苯氧乙醇在挑选的3个剂量均未能通过细菌混合菌液的挑战实验。而且通过微生物挑战实验的防腐剂剂量也要比MIC值要高。这说明选择防腐剂时在参照防腐剂的MIC的同时还要考虑产品的配方因素, 确定适宜的防腐剂配方, 正确评价其性能后再投入使用。

表3　防腐剂对日化产品中分离霉菌的挑战性实验(CFU/mL)

*霉菌混合液：黑曲霉(Aspergillusniger)；绳状青霉(Penicilliumfuniculosum).

卡松含量在0.001%，甲酯含量在0.1%，咪唑烷基脲含量在0.05%，苯甲醇含量在0.4%时，单独使用均未能通过微生物挑战。将它们复配使用对日化产品中分离的细菌进行挑战性实验，结果见表4。

表4　防腐剂复配使用对日化产品中分离细菌的挑战性实验(CFU/mL)

结果表明，这4种防腐剂在一定浓度单独使用时未能通过微生物挑战，在复配使用后对分离细菌的抑制效果较好。但本实验仅只针对洗发水基质，在其它不同配方体系产品中的抑菌效果还需进一步研究。

3　结论

本实验选择了市场上最常用的5种防腐剂，采用最低抑菌浓度(MIC)和微生物防腐挑战实验评估这几种防腐剂对日化用品中常见腐败微生物的的防腐效果。选取的5种防腐剂除卡松外，在规定的使用范围内对分离的微生物都具有较好的抑制效果；除苯氧乙醇外在洗发水中单独使用都能通过微生物挑战性实验，说明这几种防腐剂在日化产品中虽然具有较好的防腐效果，但随着在产品中长期使用，已经出现了耐药性的趋势，同时国家标准对防腐剂在日化产品中的使用限制越来越严格，如即将施行的《化妆品安全技术规范》2015版对卡松的使用范围和使用剂量都进行了进一步限定。因此单一防腐剂已经无法达到有效抑菌的效果，复合防腐剂的使用是未来的趋势。

通过将防腐剂复配使用既可以拓展抑菌谱，又可以减少每种防腐剂的用量，相对安全且经济实惠。可以将具有良好抑菌效果的防腐剂重新组合，研究各组分之间在不同配方产品中的最优配比，建立更加高效、经济的防腐体系。

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Effect evaluation of antiseptic preservatives commonly used in cosmetic products

YANG Juan1,2, LIU Yong-long1,2, LIN Rui1,2, LIANG Jian1,2, CHEN Juan1,2, Huang Xiao-mo1,2,3, QIU Xiao-yin1,2,3

1. Guangdong Demay Biological Technology Co., Ltd, Guangzhou 510663; 2.Guangdong Province antimicrobial Engineering Technology Research Center, Guangzhou 510070; 3. Guangdong Institute of Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangzhou 510070

In order to understand the antiseptic effects of preservatives commonly used in cosmetic products, the minimal inhibitory concentration and microbiology challenge test was used to evaluate the effects of different preservatives on different microbes. In the actual cosmetics products, the kathon tolerance of the microorganisms separated from the contaminated cosmetics was nearly 0.0015%, close to the standard limit. The other four kinds of preservatives within the prescribed application range had good inhibition effects on microorganisms, such as kathon at 0.0015%, methyl p-hydroxybenzoate at 0.2%, imidazolidinyl urea at 0.075%, and benzyl alcohol at 0.2%, respectively. These cosmetic products could pass microbial challenge test. Based on actual circumstances, cosmetic product enterprises should screen various compounded preservatives for establishing more efficient and economical preservative system.

preservative; minimal inhibitory concentration; microbiology challenge test

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.007

广东省科技计划项目(2013B090600148,2013B050800023)，揭阳市产学研结合项目(201429)。

杨娟(1989～)，女，硕士，工程师，电话：020-8244095。E-mail：yangjuanhust@163.com。

邱晓颖(1962～)，女，教授级高工，主要从事工业微生物控制技术研究。E-mail：xyqiu29@163.com。