多重PCR快速检测化妆品中三种致病菌的研究

杨秀茳，　郭晓苑，　文　霞，　谢小保

广东省微生物研究所，广东省微生物分析检测中心，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室 广东 广州 510070



多重PCR快速检测化妆品中三种致病菌的研究

杨秀茳，郭晓苑，文霞，谢小保*

广东省微生物研究所，广东省微生物分析检测中心，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室 广东 广州 510070

利用多重PCR技术建立快速检测化妆品中三种致病菌的方法。根据已报道的大肠杆菌phoA基因、铜绿假单胞菌外膜蛋白基因oprL和金黄色葡萄球菌特异性序列SmaI选择特异性引物，对人工染菌化妆品进行多重PCR检测。结果显示，三种致病菌的基因组DNA均可与各自引物特异性结合，扩增产物大小分别为622 bp、504 bp和426 bp。该方法用于人工污染的化妆品中，大肠杆菌的检出限浓度为103CFU/mL，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的检出限浓度为105CFU/mL。作者建立的多重PCR方法可同时快速、特异地对化妆品中三种致病菌进行检测，在化妆品行业具有较大的应用价值。

多重PCR； 化妆品； 致病菌； 检测

近几年我国化妆品消费量不断上升，其安全问题一直备受关注，其中微生物指标是化妆品卫生质量合格与否的重要影响因素。目前我国对进出口化妆品规定一律按《化妆品卫生规范》(2007版)进行检验，其中明确规定了每克或每毫升化妆品产品中不得检出粪大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，对此也列出了详细的检验方法，但是该方法需要配制各种培养基和试剂，操作繁琐，耗时4 d～7 d，且存在对一些致病性金黄色葡萄球菌、粪大肠菌群检出率很低的问题[1]。

为了适应我国化妆品行业的发展，急需建立化妆品微生物快速检测方法。多重PCR(multiplex-PCR)是在常规PCR基础上建立起来的一种新型检测技术，是在同一反应体系中同时加入多对特异性引物扩增出多条目的DNA片段的PCR反应，可用于多种病原微生物的同时快速检测或鉴定[2-4]。该技术以快速、经济、高效的优势已被用于食品或环境中同时检测多种病原微生物[5-11]。近几年，PCR技术在化妆品检测行业也得到了应用，但还停留在对单个菌株的检测[12-13]，而同时检测化妆品中大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的方法还未有相关报道。本文对化妆品中大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测做了初步研究，以期建立一种快速、准确的化妆品微生物检测方法。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器Centrifuge5424小型高速离心机(Eppendorf)、紫外分光光度计(METASH UV-5200PC)、 Mastercycler®nexus GSX1梯度PCR仪(Eppendorf)、凝胶成像分析系统(Bio-Rad)。

1.1.2主要试剂2xEasyTaq®PCR SuperMix、Trans2K®PlusDNA Maker、Agarose(北京全式金生物技术有限公司)，细菌DNA提取试剂盒(HiPure Bacterial DNA Kit，Magen)，营养琼脂(NA)培养基(广州环凯微生物科技有限公司)。

1.1.3引物合成

根据大肠杆菌的持家基因phoA、铜绿假单胞菌的外膜蛋白基因oprL和金黄色葡萄球菌的特异性序列SmaI，利用Primer5.0分析筛选文献引物，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，其序列及扩增长度见表1。

表1　目的基因名称及引物序列

1.1.4菌株

标准菌株：大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC8739、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) ATCC6538、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC9027，均购自广东省菌种保藏中心，由本实验室保存。

污染菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)，嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)，恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，由本实验室从污染化妆品中分离。

1.1.5样品

某化妆品公司送检的化妆水和保湿乳，分别编号为H和B，采用传统方法检测无微生物污染。

1.2方法

1.2.1菌液制备

分别挑取3支标准菌株和6支污染菌株培养基上的单菌落接种于NA平板上，37 ℃培养18 h。分别制备9株菌的菌悬液和3株标准菌的混合菌悬液，浓度为108CFU/mL，然后将混合菌液稀释至102CFU/mL，即制备成了浓度分别为108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL和102CFU/mL的菌悬液。

1.2.2模板DNA制备

首先分别吸取9种菌悬液和3种标准菌的混合菌悬液各1 mL于1.5 mL离心管中，离心去上清，收集菌体，采用试剂盒提取基因组DNA，-20 ℃保存备用。

1.2.3PCR特异性分析

分别以3个标准菌株、3个混合标准菌株和6个污染菌株的DNA为模板，用3对引物进行PCR扩增，反应体系(28 μL)：2xEasyTaq®PCR SuperMix 14 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板1 μL，ddH2O补足至28 μL。反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.4人工污染样品

取3组15mL离心管，每组7支，第一组加生理盐水，9 mL/支，编号7、6、5、4、3、2、1；第二组化妆水9g/支，编号B7、B6、B5、B4、B3、B2、B1；第三组保湿乳9g/支，编号H7、H6、H5、H4、H3、H2、H1。

每组离心管依次加入1 mL 108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL和102CFU/mL的混合菌液，充分混匀，即制备成107CFU/mL、106CFU/mL 、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL和101CFU/mL的生理盐水对照样品组和B、H实验样品组。离心去上清，对照组菌体沉淀直接提取DNA，实验组用生理盐水将菌体沉淀重复洗涤3次后提取细菌DNA，-20 ℃保存备用。

1.2.5多重PCR测定灵敏度

以人工污染样品中的混合DNA为模板，同时用3对引物进行多重PCR扩增。通过对多重PCR反应体系参数进行优化，确定了最佳反应体系(28μL)：2xEasyTaq®PCR SuperMix 14 μL，3对上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，模板1 μL/2 μL，ddH2O补足至28 μL。反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，进行35个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.6PCR产物电泳检测

以Trans2K®PlusDNA Maker作相对分子质量指示，取PCR扩增产物5 μL用1%琼脂糖凝胶(含染色剂Gold view)在120 V电压下电泳30 min，然后置于凝胶成像分析系统中观察结果并拍照。

2　结果与讨论

2.1结果

2.1.1多重PCR扩增结果及特异性分析

根据所筛选的3对特异性引物对3个标准菌株、3个混合标准菌株和6个污染菌株的基因组DNA进行PCR扩增，检测3对引物的特异性，结果显示3对引物均能与对应的菌株发生特异性结合，出现了与预期扩增长度相一致的清晰条带，6株其他菌株均未扩增出条带，结果见图1和表2。

M：Trans2K®PlusDNA Maker；1：EscherichiacoliATCC8739；2：PseudomonasaeruginosaATCC9027；3：StaphylococcusaureusATCC6538；4：三株标准菌混合；5：Bacillussubtilis；6：Staphylococcussaprophyticus；7：Klebsiellapneumonia；8：Stenotrophomonasmaltophilia；9：Burkholderiacepacia；10：Pseudomonasputida

图1　多重PCR扩增特异性

“+”：表示PCR扩增阳性；“-”：表示PCR扩增阴性

2.1.2人工污染样品的多重PCR扩增灵敏度

用不同浓度的混合标准菌液污染化妆水和保湿乳两个样品，比较两者可检出的菌液浓度，同时以相应浓度的生理盐水菌液为对照，检测多重PCR灵敏度。

不同浓度的生理盐水混合菌液提取DNA后进行多重PCR扩增，污染菌液浓度为105～107CFU/mL时，3种菌株均扩增出目的条带，污染菌液浓度为104CFU/mL时，只有大肠杆菌扩增出了清晰条带，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌扩增出了较淡的条带，可辨度低，菌液浓度在101～103CFU/mL时，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌已无目的条带出现，只有大肠杆菌在103CFU/mL浓度处扩增出较淡条带。可见，在生理盐水对照样中，大肠杆菌的可检出菌液浓度最低限度为103CFU/mL，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的可检出菌液浓度最低限度为104CFU/mL，结果见图2。

两个人工污染的化妆品样品之间，以及两者与生理盐水菌液之间比较，检出效果差异不大，可检出的条带在长度上相一致，表明经过3次洗涤后，化妆品成分并未对基因组DNA提取产生影响。在污染浓度为105～107CFU/mL时，两者都能清晰检出3株菌的条带，在污染浓度为101～104CFU/mL时，两者均未检出铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的条带，只有大肠杆菌在104CFU/mL和103CFU/mL浓度处出现了较淡的条带。可见，两个污染化妆品样品中，采用多重PCR技术可检出103CFU/mL以上浓度的大肠杆菌以及105CFU/mL以上浓度的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，结果见图2。

2.2讨论

作者多年的检测工作中，经常在化妆品中检出铜绿假单胞菌，检出量大，甚至是批量污染。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌虽检出相对较少，但也有检出，尤其是在天气潮湿的季节，送检量和检出率明显加大。这3种菌株均为常见的致病菌，大肠杆菌在免疫力低下的人体中容易引起感染，金黄色葡萄球菌在敏感型群体内可引起呼吸道疾病[11，14]。铜绿假单胞菌附着在人身上可引起人皮肤化脓性感染[15]。化妆品中存在其中任何一种菌都对人体健康存在威胁，因此，研究这三种致病菌株的快速检测方法是必要的。

本研究在查阅并分析了相关文献后筛选了3对目标基因的特异性引物，其中大肠杆菌phoA基因是其持家基因[16]，许一平等[17]采用一对引物同时扩增3种菌的基因组DNA的方法验证了其特异性。金黄色葡萄球菌的SmaI基因被证实为其特异性序列，徐晓可等[18]采用10株金黄色葡萄球菌、46株非金黄色葡萄球菌以及对43份食品样品的检测验证了该基因具有很好的特异性。oprL是铜绿假单胞菌特有的外膜蛋白基因，张淑红等[19]通过比较检测人工污染样品的传统培养法和分子生物学方法以及对自然界中的8个水体样品的检测验证了该基因的特异性。

M：Trans2K®PlusDNA Maker；1～7：生理盐水对照样品，编号1、2、3、4、5、6、7，即混合菌浓度依次为101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL和107CFU/mL；8～14：化妆水B样品，编号B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7，即人工加菌终浓度依次为101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL和107CFU/mL；15～21：保湿乳H样品，编号H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7，即人工加菌终浓度依次为101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL和107CFU/mL。

图2人工污染样品的多重PCR扩增灵敏度

本研究根据3对引物的Tm值确定各自的退火温度，首先建立了单重PCR的反应条件，扩增出片段长度分别为622 bp、426 bp和504 pb的3个保守序列，验证了3对目标基因引物的特异性。同时在单重PCR的基础上，调整和优化了多重PCR的引物浓度和退火温度，进行了多次预实验，最终确定了反应体系和条件。建立的多重PCR反应体系不存在引物错配、交叉扩增，也没有引物二聚体的产生，具有很好的特异性，可以有效地在化妆品中同时检测大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，整个过程只需1 d，可检出的菌量分别为大肠杆菌103CFU/mL、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌105CFU/mL。

但是与传统方法相比，本实验建立的多重PCR检测灵敏度偏低，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的检测灵敏度低于大肠杆菌，原因可能是提取混合菌液基因组DNA时浓度存在差异，也可能是反应体系中引物浓度的配比还没达到最佳，作者将在后续的实验中继续进行研究。在实际样品的检测中，通过预先进行增菌的方式提高多重PCR检测的灵敏度。

3　结论

化妆品微生物污染不仅给企业带来经济损失，更严重危害人体健康，因此快速有效的化妆品微生物检测至关重要，本研究建立的多重PCR检测方法可同时、快速、准确检测化妆中的大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，为化妆品行业的快速检测技术提供了基础，在化妆品行业具有较大的应用价值。

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Rapid detection of three types of bacterial pathogens in cosmetics by multiplex PCR

YANG Xiu-jiang, GUO Xiao-yuan, WEN Xia, XIE Xiao-bao

Guangdong Institute of Microbiology, Guangdong Detection Center of Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, Guangzhou, Guangdong 510070, China

A multiplex PCR (m-PCR) method for rapid detection of three types of bacterial pathogens in cosmetics was developed. According to the reported, three pairs of primers were chosen for the m-PCR detection of artificially contaminated cosmetics, based on thephoA gene ofEscherichiacoli, the outer membrane protein (OMP)oprL gene ofPseudomonasaeruginosaand theSmaI specific sequence ofStaphylococusaureus. The results indicated the three pairs of primers bound specifically to the genomic DNA of the three types of bacterial pathogens and amplified three fragments of 622 bp forEscherichiacoli, 504 bp forPseudomonasaeruginosaand 426 bp forStaphylococcusaureus. In the case of artificially contaminated cosmetics, the detection limits of 103CFU/mL forEscherichiacoliwere achieved, and the detection limits of 105CFU/mL forPseudomonasaeruginosawere achieved as well asStaphylococusaureus. This m-PCR method could provide a simultaneous, rapid and specific detection for three types of bacterial pathogens in cosmetics, and have greater practical application values.

multiplex PCR; cosmetics; bacterial pathogens; detection

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.011

广东省科技计划项目(2014A040401054)，揭阳市产学研结合项目(0201)。

杨秀茳(1987～)，女，助理工程师。E-mail：xiujiangjiang99@163.com。

谢小保(1966～)，男，研究员。E-mail：xiaobaoxie@126.com。