罐内水性涂料抗微生物侵染的试验方法研究

郭晓苑，　李彩玲，　谢飞鸿，　刘静霞，　周少璐，　谢小保

广东省微生物研究所，华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广州 510070



罐内水性涂料抗微生物侵染的试验方法研究

郭晓苑，李彩玲，谢飞鸿，刘静霞，周少璐，谢小保*

广东省微生物研究所，华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广州 510070

本文介绍了推荐性国家标准GB/T30792-2014《罐内水性涂料抗微生物侵染试验方法》制订的必要性及制订依据。针对标准适用范围、测试菌种、测试条件和实验程序等内容分别进行了系统的描述。

水性涂料； 抗菌性能； 测试标准

水性涂料主要由乳液、颜料、填充料、助剂和水组成，为微生物的生长创造了良好的条件，在温度适宜时会促使微生物在罐内生长繁殖产生代谢作用，从而引起产品pH值、气味、色泽、凝聚、破乳、粘度等变化，造成产品变质。为了防止微生物在水性涂料储藏和使用过程中的生长繁殖，保护产品不被破坏，须在水性涂料中加入防腐剂,抑制或杀死微生物，延长产品的保藏时间[1-4]。但是加入防腐剂后，水性涂料的抗微生物侵染的效果及其稳定性需要一个科学的检测方法与评价体系来进行测试和评价，因此，建立抗微生物侵染功效的测试方法具有重要的实际意义。

目前水性涂料在罐内贮藏期间抗微生物侵染性能测试方法主要有美国材料与试验协会标准ASTM D 2574-06《容器中乳化漆耐微生物侵染的试验方法》，该标准于2012年进行了修订，我国还没有相关测试方法和评价标准，不同的企业、不同的协会测试时，采用的试验菌种、接种方式、培养方法等都有一定的差异。因此为规范水性涂料抗微生物侵染功效的评价方法，防止水性涂料受到微生物污染，需要研究制订水性涂料的抗微生物侵染的试验方法和评价标准[5-6]。

1　测试菌种

水性涂料抗微生物侵染功效试验中测试菌株的选择非常重要。选用实际使用过程中经常污染的微生物，能更好地代表实际污染状况和正确评价防腐体系的作用效果。一般应包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌中的至少一种。由于使用前罐内涂料密封包装，空气少，不适合霉菌生长。因此霉菌引起罐内涂料变质的可能性较低。美国ASTM D 2574推荐使用假单胞菌(如铜绿假单胞菌)和肠杆菌(如产气肠杆菌)，同时还可选择从腐败变质的涂料中分离的菌作为测试菌。

通过对我国水性涂料微生物污染情况的调查研究，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌和白色假丝酵母是常见的涂料中污染微生物，因此选用这些菌种进行抗微生物侵染功效试验，本标准采用菌种为大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC 25922，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 6538，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 10145，产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)ATCC 49701。

根据产品的用途，可增加其他细菌作为测试菌种。

2　接种和培养

培养方法有涂布培养法和稀释培养法

涂布培养方法：称取100 g供测试的样品2份，分别接种1 mL细菌菌悬液和1 mL酵母菌悬液，充分混合均匀，将样品保存在30 ℃±2 ℃条件下，并于0时、第3 d、第5 d、第7 d分别测定样品中的细菌和酵母菌含量。如果第7d没有检测到微生物，则重新接种。将2个无菌棉签分别浸入已接种的2个涂料试样中，通过在容器侧壁上轻轻挤压棉签去掉多余的涂料(大约有200 mg的涂料会留在棉签上)。将接种细菌的棉签头上的涂料均匀地涂布在TSA平板表面上，将接种酵母菌的棉签头上的涂料均匀地涂布在PDA平板表面上(相对保持在棉签上的200 mg涂料，约只有50 mg的涂料会被涂在平板上)，试验重复3次。TSA平板置于36 ℃±1 ℃恒温培养24 h～48 h，计数得到细菌菌落数， PDA培养基置于28 ℃±1 ℃培养48 h～72 h，计数得到酵母菌落数。

稀释培养法：将供测试的样品分成两份各100 g，然后分别接种1 mL混合细菌液和1 mL酵母菌悬液，充分混合均匀，将样品保存在30 ℃±2 ℃条件下，并于0 d、第3 d、第7 d、第14 d 、第21 d和第28 d分别测定样品中的细菌和酵母菌含量。取10 g样品加入到含90 mL稀释液的锥形瓶中，充分摇匀做成1∶10的均匀稀释液；吸取1∶10稀释液1.0 mL加到9.0 mL稀释液中，混匀做成1∶100稀释液，依此方法可做成10倍递增稀释液。在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的移液管吸取1 mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。细菌培养基采用TSA培养基，36 ℃±1 ℃恒温培养24 h～48 h，酵母菌培养基采用PDA培养基。

3　防腐效果评价

涂布培养法按下表1对水性涂料抗微生物侵染功效进行等级评价，0级抗微生物效果最好，3级效果最差。

表1　涂布培养法抗微生物侵染功效分级表

稀释培养法采用评价等级(见表2)为：细菌于第7 d时细菌菌落总数减少百分率，至第28 d时无增长，酵母菌于第7 d时菌落总数减少百分率，至第28 d时无增长等条件为产品的抗微生物性能设立4个评价等级即0级、1级、2级和3级。等级的判断要以细菌和酵母菌同时符合要求为条件，如果细菌和酵母菌的评判等级有差异时，以数字大的等级作为最终的产品评价等级。

表2　稀释培养法抗微生物侵染功效分级表

4　方法验证

4.1防腐剂功效验证

在水性涂料中加入不同抗菌剂或不同含量相同抗菌剂，采用单一菌接种培养和混合菌接种培养进行抗微生物侵染试验。结果见表3。结果表明，除样品F外，单一菌接种培养与混合菌接种培养的结果一致，由于混合菌接种法更能代表实际污染的条件和状况，测试结果能真实反映产品抗微生物侵染的功效，能保证产品的安全，且更相对省时省力，因此混合菌接种的方法更容易被生产企业所采用和接受，所以本标准采用混合菌接种方法进行抗微生物侵染功效的测试和评价。

表3　抗微生物侵染效能测试结果

虽然采用涂布培养法和稀释培养法测试结果的评价等级相同，但是测试过程中发现，涂布培养法计数时易受到水性涂料的的干扰，加入TTC后有助于菌落计数，但该法相对更加省时省力，而稀释培养法计数不受水性涂料性状的影响，结果更加稳定，但试验工作量大且时间长。

4.2产品方法验证

根据本标准试验方法对市场上销售的水性涂料产品进行了抗微生物侵染功效的检测，检测结果见表4。结果显示市售水性涂料的抗微生物侵染效果较好，多数产品都达到了0级。1级和2级各有一个产品。检测结果进一步验证了该方法的可行性。

表4　市售水性涂料抗微生物侵染效能实验

注：*为0 d的菌落数。

4.3比对试验验证结果

检测人员对不同品牌水性涂料和对照样进行了比对实验，考核方法的重复性及可靠性，经过实验证明不同的检测人员对同一样品测试结果的重复性较好，比对测试结果见表5。

5　结论

依据本研究制订的国家标准GB/T30792-2014《罐内水性涂料抗微生物侵染试验方法》，其部分内容参考了美国材料与试验协会标准ASTM D 2574-06(2012))，并增加了涂料中其他常见的污染菌作为测试菌种，菌种代表性更强，为了更好的定量评价涂料的抗微生物侵染效果，参考ASTM E 640-06水性化妆品防腐功效的测试方法[7]，增加了稀释培养法，引入了微生物减少百分率，能定量的表征涂料的抗微生物侵染效果，消除了微生物测试时的抗菌剂的抑菌作用，结果更加准确，使标准具有更强的可操作性和适用性。

表5　不同检测人员的比对试验

[1]陈逸君，杨光雄、朱优君.水性涂料及其原料的防腐、防霉.涂料工业[J].2003，33(3):49-50.

[2]谢俊斌, 陈北秋. 水性涂料罐内防腐杀菌剂稳定性研究[J]. 涂料工业, 2007, 37(3):59-61.

[3]王玉琦，杨云峰. 水性建筑涂料中防霉剂的选择[J]. 中国涂料, 2005,20(5):46-49.

[4]彭红，谢小保，欧阳友生等.涂料用防霉剂、抗菌剂和抗藻剂[J].中国涂料，2007,22(12):48-53.

[5]中华人民共和国国家标准，GB/T30792-2014 罐内水性涂料抗微生物侵染的试验方法 [S].北京：中国标准出版社，2014:1-8.

[6]ASTM D 2575-2006(2012) Standard test method for resistance of emulsion paints in the container to attack by microorganisms[S]. West Conshohocken,2012.

[7]ASTM E640-2006(2012) Standard Test Method for Preservatives in Water-Containing Cosmetics[S]. West Conshohocken,2012.

Test method of water-borne coatings in containers for resisting microorganism contamination

GUO Xiao-yuan, LI Cai-ling, XIE Fei-hong, LIU Jing-xia, ZHOU Shao-lu, XIE Xiao-bao

Guangdong Institute of Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, Guangzhou 510070

The necessity and basis of developing recommended national standard GB/T30792-2014 test method of water-borne coatings in the containers for resisting microorganism contamination were introduced, and the applied scope of the standard, tested strains，testing conditions and testing procedures were described systematically.

water-borne coatings； antibacterial activity； test method

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.012

郭晓苑(1982～)，女，大学本科，研究方向，有害微生物防治。E-mail: 123736489@qq.com。

谢小保(1966～)，男，研究员，主要从事工业材料抗菌防霉机理的研究。E-mail：xiaobaoxie@126.com。