长链非编码RNA MEG3在心肌梗死患者血清中的表达及意义

潘洪川 刘海燕 张月超 肖大宴 谢清平

临床研究

长链非编码RNA MEG3在心肌梗死患者血清中的表达及意义

潘洪川 刘海燕 张月超 肖大宴 谢清平

目的 探讨检测长链非编码RNA MEG3（MEG3）在急性心肌梗死（AMI）患者早期血清中的表达及其临床意义。方法 采用实时荧光定量PCR（Real time PCR）检测我院收治的48例AIM患者发病后不同时间点及30名正常对照组人员血清MEG3的表达水平，分析其与血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）和心肌肌钙蛋白I（cTnI）表达水平的相关性。结果健康人血清中CK-MB及cTnI浓度分别为（10.17±2.08）IU/L和（0.69±0.17）ng/L。AMI患者血清CK-MB及cTnI水平显著升高，胸痛发作后3 h可以观察到这种明显的变化，此后这种改变迅速增大并在12 h达到峰值。正常情况下血清MEG3维持在一个比较低的水平。AMI患者血清MEG3表达水平较正常对照组显著升高（P<0.05），胸痛发作后1 h血清MEG3表达即迅速上升达到一个较高水平，此后这种改变迅速增大并在3 h达到峰值，最高可达正常表达值38倍多。相关分析发现，血清MEG3的表达与CK-MB和CTnI呈正相关（CK-MB r=0.684，P<0.01；cTnI r=0.721，P<0.01）。结论 AMI患者早期血清MEG3表达水平显著升高，可能是潜在的AMI早期血清标志物。

长链非编码RNA MEG3； 急性心肌梗死； 血清标志物

急性心肌梗死（acute myocardialinfarction，AMI）是全球范围内发病率和死亡率最高的心血管疾病，主要是由于持续的严重缺血导致心肌组织急性坏死[1]。近年来的研究表明，非编码 RNA（noncoding RNA，ncRNAs）在急性心肌梗死的发病过程中发挥着重要作用[2]。其中，有关微小 RNA（micro RNA，miR）在心血管系统疾病领域的研究最为广泛。有研究表明，miR-1、miR-499和 miR-208在急性心梗患者血清中的表达水平均明显升高，提示其有望成为诊断急性心肌梗死潜在的生物学标志物和治疗靶点[3-5]。长链非编码 RNA（long noncoding RNA，lncRNAs）是近年来发现的一类转录本长度超过200 nt的非编码RNA，可以在不同层面调控基因的表达。已有研究表明，血清中的lnc RNA（LIPCAR）可以作为评估心力衰竭预后的生物学标志物[6,7]。然而，lncRNAs能否作为急性心肌梗死的生物学标志物目前相关报道甚少。

最近研究发现的母系表达基因3（materally expressed gene 3，MEG3）是第一个被发现有肿瘤抑制功能的IncRNA。MEG3表达于多种正常组织中[8,9]。然而一些肿瘤细胞株中MEG3不表达，提示IncRNA具有抑制细胞生长的潜力[10,11]。目前针对MEG3的研究主要集中在肿瘤。研究表明，该基因表达量的增加能有效抑制癌细胞增殖；还有研究报道，在小鼠受损伤的骨骼肌中MEG3的表达增高[12]。但MEG3基因对心肌细胞的影响还没有相关报道。本研究通过测定急性心肌梗死患者及正常对照组血清中LncRNA MEG3的表达水平，评价MEG3在急性心肌梗死患者血清中的变化趋势及意义，判定MEG3在急性心梗诊断及治疗中的潜在作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2013年10月至2015年1月期间相继在我院心血管内科住院的急性心肌梗死患者48例，以及30名健康对照者。急性心梗组按照 AMI发生后时间分为 0～2 h（5例）、2～6 h（5例）、6～12 h（7 例）、12～24 h（10 例）、24～48 h（10例）、48～72 h（7 例）、72～96 h（4 例）。AMI诊断按照WHO的AMI诊断标准：典型的临床表现、特征性的ECG改变、血清心肌标志物水平动态改变，3项中具备2项，特别是后2项即可确诊。对照组对象行冠状动脉造影检查，排除冠心病的诊断。排除标准：既往心力衰竭、心肌病、房颤等心脏疾病病史，明确的恶性肿瘤，近期内接受过外科手术，近期肌肉损伤史等可能影响肌源性micro RNA以及lnc RNAs水平的因素。所有入选病例入院后即刻用含抗凝剂的紫色采血管采集2管静脉血（5 ml），一管即刻送检心肌损伤标志物；另一管静置于4℃冷藏30 min后，室温下3000 rpm离心15 min，留取上层血清，置于-20℃冰箱备用。所有入选病例入院后24 h内行常规体检、实验室检查（血常规、血生化）及心电图、心脏彩超等。同时收集两组临床资料，包括性别，年龄，是否患有高血压、高脂血症、糖尿病等。两组的临床资料比较未见统计学差异（P>0.05）。所有入选者均签署知情同意书，经我院伦理委员会批准。

1.2 血清总RNA提取 将分离所得血清置于冰上融化；取 250 μl血清样品，加入 750 μl Trizol，振荡器混匀，静置5 min；加入200 μl氯仿，振荡器混匀，静置10 min；室温下12 000 rpm离心10 min，留取上清液并测量其体积，转移至另一个无Rnase的EP管中；分别加入与上清液等体积的异丙醇，振荡器振荡混匀，室温下静置3 min；室温下12 000 rpm离心10 min；倒出管内液体，加用1 ml 75%乙醇；室温12 000 rpm离心2 min；倒出乙醇，并用Tip枪头将剩余液体吸干净，晾干。每管中加入 10 μl无Rnase的ddH2O，以能够充分溶解RNA；用分光光度计测定总RNA浓度及纯度。

1.3 Real-time PCR分析LncRNA MEG3的表达水平 提取血清总RNA，逆转录反应参照AMV逆转录试剂盒说明，在20 μl体系中加2 μg总RNA进行cDNA的合成。Real-time PCR采用2xSYBR Green PCR Master Mix，取适量cDNA作为模板，引物浓度 0.4 μmol/L，15 μl体系进行扩增，每个待测样本设置3个平行样，根据目标基因设计合成相应上下游引物进行PCR扩增，以GAPDH作为内参照。PCR反应在定量PCR反应仪上进行。3次独立实验后得到的数据运用公式RQ=2-ΔΔCt的方法进行分析。

1.4 血清CK-MB和cTnI的检测 血清CK-MB和cTnI检测均采用酶联免疫吸附法（ELISA）。酶联免疫分析试剂盒由上海华壹生物技术有限公司提供，实验严格按试剂盒说明进行。CK-MB正常参考范围为 0～25 IU/L，cTnI正常参考范围为 0～1.5 ng/L。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。血液标本中MEG3、CK-MB及cTnI mRNA的表达差异采用t检验或One-way ANOVA方差分析，用±s表示；MEG3与CK-MB及cTnI相关性分析采用线性回归法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AIM患者血清CK-MB及cTnI表达情况 健康人血清中CK-MB及cTnI浓度分别为（10.17±2.08）IU/L 和（0.69±0.17）ng/L。AMI患者血清 CKMB及cTnI水平可显著升高，胸痛发作后3 h可以观察到这种明显的变化，此后这种改变迅速增大并在12 h达到峰值。

正常对照组血清中CK-MB及cTnI水平在正常值范围内，各时间点与AMI组相比差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.2 AMI患者血清MEG3的表达情况 正常情况下血清MEG3维持在一个比较低的水平。AMI患者血清MEG3表达水平较正常对照组显著升高（P<0.05），胸痛发作后1 h血清MEG3表达即迅速上升达到一个较高水平，此后这种改变迅速增大并在3 h达到峰值，最高可达正常表达值38倍多（图2）。

图1 不同时间点CK-MB及cTnI的变化

图2 AMI患者血清MEG3的表达

2.3 血清MEG3与CK-MB及cTnI相关性分析 线性相关分析48例患者血清MEG3与CK-MB及cTnI表达的相关性，结果提示，MEG3与CK-MB及cTnI的表达呈正相关（CK-MB r=0.684，P<0.01；cTnI r=0.721，P<0.01）。见图 3。

3 讨论

急性心肌梗死（AMI）是指因持久而严重的心肌缺血所致部分心肌急性坏死[13]。在临床上常有胸痛、急性循环功能障碍，以及反映心肌损伤、缺血和坏死等一系列特征性的心电图改变。临床表现常有持久的胸骨后剧烈疼痛、急性循环功能障碍、心律失常、心功能衰竭、发热、白细胞计数和血清心肌损伤标记酶升高。临床上主要根据症状、心电图和心肌酶学检查来诊断AMI[14]。传统的心肌酶学检查包括CK-MB及cTnI，虽然CK-MB及cTnI对 AMI具有高度的特异性和敏感性，但是AMI患者心肌梗死发生后3 h血清CK-MB及cTnI会出现升高，然而这种改变在心肌梗死发生后6～8 h才比较明显，约12 h达到峰值，因此对早期诊断AMI价值有限。近年来对lncRNA的研究发现，lncRNA与人类疾病的发生发展有着极为密切的关系。研究结果证实，外周血中含有丰富的稳定表达的LncRNA[15,16]。新近研究发现，疾病如恶性肿瘤患者血清中的lnc RNA表达失调。因此，lncRNA可能是一个理想的基于血液的疾病检测评估指标及治疗靶点。近年来的研究发现，lncRNAs在心肌组织中有高度的组织表达特异性。全基因组对于心肌梗死后心脏转录组的分析显示，大量的心脏特异性lncRNAs对于心肌不良重塑、心肌再生、心功能等具有独特的监管和功能特性，这个发现意味着心脏特异性LncRNAs有充足的可能性可以作为心脏发育和与疾病相关的靶向分子和生物标志物[17,18]。研究发现，lncRNA BC088254在心脏的发育中起到重要作用，敲除LncRNA 143260导致胚胎干细胞分化中的心肌细胞失去搏动能力，并使心脏关键转录因子（Hand2、Myocardin、Nkx2-5、Gata4、Mef2c 等） 失活[19]。 lnc RNA-Ang362的敲除可抑制血管平滑肌细胞的增殖，从而影响血管相关疾病的进展[20]。LncRNASRA作为核受体信号转导的共激活因子，在斑马鱼中敲低LncRNA-SRA表达后，能引起心室肌收缩功能障碍[21]。这些结果均提示，ncRNA可作为潜在的治疗靶点。尿路上皮癌相关1（Urothelial carcinoma associated 1，UCA1）是一种最初在膀胱移行细胞癌中确定的lncRNA，整个序列包括3个长度1.4 kb的外显子。因为它在膀胱移行细胞癌中高表达，可作为诊断膀胱癌潜在的生物标志物。近年来的研究发现，循环lncRNA UCA1可作为新的急性心肌梗死标志物[22]。然而在心脏方面对于lnc RNAs的研究仍处于起步阶段，关于lncRNA MEG3与心肌梗死方面的研究目前尚未见相关报道。本研究采用实时荧光定量PCR（Real time PCR）检测我院收治的48例AMI患者发病后不同时间点及30名正常对照组人员血清MEG3的表达水平，分析其与血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）和心肌肌钙蛋白I（cTnI）表达水平的相关性。结果显示，正常情况下人血清中lncRNA MEG3表达水平很低，AMI可以导致血清lncRNA MEG3水平迅速升高，胸痛发作后1 h即可出现明显改变，并迅速升高，在3 h左右达到峰值，最高可达正常表达值数十倍。这一试验结果证实，血清LncRNA MEG3可以有效评估AMI早期心肌损伤，其反应速度要强于CK-MB及cTnI。lncRNA MEG3的表达与CK-MB及cTnI呈正相关。

图3 血清MEG3的表达与CK-MB及cTnI的相关性

综上所述，lncRNA MEG3有望成为新的早期诊断AMI的血清学指标。在胸痛发作1 h左右lncRNA MEG3即可升高，可作为AMI早期诊断和鉴别诊断标志物，具有较好的临床应用前景，然而其具体机制仍需进一步深入研究。

［1］Diez M，Talavera ML，Conde DG，et al.High sensitive troponin is associated with high risk clinical profile and outcome in acute heart failure.Cardiol J，2015，6：21-24.

［2］Sandhu GK，Milevskiy MJ，Wilson W，et al.Non-coding RNAs in Mammary Gland Development and Disease.Adv Exp Med Biol，2016，886：121-153.

［3］Cheng Y，Wang X，Yang J，et al.A translational study of urine miRNAs in acute myocardial infarction.J Mol Cell Cardiol，2012，53：668-676.

［4］Liu X，Fan Z，Zhao T，et al.Plasma miR-1，miR-208，miR-499 as potential predictive biomarkers for acute myocardial infarction：An independentstudy ofHan population.Exp Gerontol，2015，72：230-238.

［5］Sayed AS，Xia K，Yang TL，et al.Circulating microRNAs:a potential role in diagnosis and prognosis of acute myocardial infarction.Dis Markers，2013，35：561-566.

［6］Oloomi M，Yardehnavi N，Bouzari S，et al.Non-coding CK19 RNA in peripheral blood and tissue of breast cancer patients.Acta Med Iran，2013，51：75-86.

［7］Zhang J，Gao C，Meng M，et al.Long Noncoding RNA MHRT Protects Cardiomyocytes against H2O2-Induced Apoptosis.Biomol Ther（Seoul），2016，24：19-24.

［8］ Binse I， Ueberberg B， Sandalcioglu IE， et al.Expression analysisofGADD45gamma， MEG3， and p8 in pituitary adenomas.Horm Metab Res，2014，46：644-650.

［9］Zamani M，Sadeghizadeh M，Behmanesh M，et al.Dendrosomal curcumin increases expression of the long non-coding RNA gene MEG3 via up-regulation of epi-miRs in hepatocellular cancer.Phytomedicine，2015，22：961-967.

［10］Hu D，Su C，Jiang M，et al.Fenofibrate inhibited pancreatic cancer cells proliferation via activation of p53 mediated by upregulation of LncRNA MEG3.Biochem Biophys Res Commun，2016，5：19-23.

［11］Tian ZZ，Guo XJ，Zhao YM，et al.Decreased expression of long non-coding RNA MEG3 acts as a potential predictor biomarker in progression and poor prognosis of osteosarcoma.Int J Clin Exp Pathol，2015，8：15138-15142.

［12］Luo G，Wang M，Wu X，et al.Long Non-Coding RNA MEG3 Inhibits Cell Proliferation and Induces Apoptosis in Prostate Cancer.Cell Physiol Biochem，2015，37：2209-2220.

［13］Argay M，Koos I，Takacs I，et al.Pharmaceutical care for patients with acute myocardial infarction in Hungary.Int J Clin Pharmacol Ther，2013，51：91-95.

［14］Wallentin L，Bergstrand L，Dellborg M，et al.Low molecular weight heparin（dalteparin）compared to unfractionated heparin as an adjunct to rt-PA（alteplase）for improvement of coronary artery patency in acute myocardial infarction-the ASSENT Plus study.Eur Heart J，2003，24：897-908.

［15］Quinn L，Finn SP，Cuffe S，et al.Non-coding RNA repertoires in malignant pleural mesothelioma.Lung Cancer，2015，90：417-426.

［16］Rossbach O，Bindereif A.Eukaryotic non-coding RNAs：new targets for diagnostics and therapeutics?Pharmazie，2016，71：3-7.

［17］Rayner KJ，Liu PP.Long Noncoding RNAs in the Heart:The Regulatory Roadmap of Cardiovascular Development and Disease.Circ Cardiovasc Genet，2016，9：101-103.

［18］Lorenzen JM，Thum T.Long noncoding RNAs in kidney and cardiovascular diseases.Nat Rev Nephrol，2016，3：11-15.

［19］Li X，Zhang L，Liang J.Unraveling the Expression Profiles of Long Noncoding RNAsin RatCardiac Hypertrophy and Functions oflncRNA BC088254 in Cardiac Hypertrophy Induced by Transverse Aortic Constriction. Cardiology，2016，134：84-98.

［20］Leung A，Trac C，Jin W，et al.Novel long noncoding RNAs are regulated by angiotensinⅡin vascular smooth muscle cells.Circ Res，2013，113：266-278.

［21］ Wongtrakoongate P， Riddick G， Fucharoen S， etal.Association of the Long Non-coding RNA Steroid Receptor RNA Activator(SRA)with TrxG and PRC2 Complexes.PLoS Genet，2015，11：e1005615.

［22］Yan Y，Zhang B，Liu N，et al.Circulating Long Noncoding RNA UCA1asaNovelBiomarkerofAcuteMyocardial Infarction.Biomed Res Int，2016，2016：8079372.

The expression and significance of serum long non encoding RNA MEG3 in patients with acute myocardial infarction

PAN Hong-chuan，LIU Hai-yan，ZHANG Yue-chao，et al.Department of Cardiology，Meishan People′s Hospital，Chengdu 620010，China

Objective To investigate the expression and clinical significance of long non encoding RNAMEG3（MEG3）in serum of patients with acute myocardial infarction（AMI）.Methods The blood samples were collected from 48 cases AMI patients at different times and 30 normal subjects.The serum MEG3，CK-MB and cardiac troponin I（cTnI） expression were measured using real-time fluorescence quantitative PCR（real time PCR）.The relationship between MEG3 with CK-MB and cardiac troponin I（cTnI）were analyzed.Results The concentrations of CK-MB and cTnI in the serum of healthy people were（10.17±2.08）IU/L and （0.69±0.17）ng/L.The serum levels of CK-MB and cTnI were significantly increased in AMI patients，and after 3 h of chest pain could be observed in this kind of changes，and the changes were rapidly increased and reached the peak at 12 h after the onset of chest pain.In normal control group，serum MEG3 was maintained at a relatively low level.The level of serum MEG3 in patients after 1 h AMI attack was significantly higher（P<0.05），and the serum MEG3 could reach the peak after 3 h of AMI attack.Correlation analysis showed that the expression of serum MEG3 positive correlation between CK-MB and cTnI （CK-MB r=0.684，P<0.01，cTnI r=0.721，P<0.01）.Conclusion The expression of serum MEG3 in the early stage of AMI is significantly elevated，which may be a potential marker for early serum AMI.

Long non encoding RNA MEG3； Acute myocardial infarction； Serum marker

PAN Hong-chuan，E-mail：panhongchuanmed@163.com

620010 四川省成都市，眉山市人民医院心内科

潘洪川，E-mail：panhongchuanmed@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．11．007

R542.2+2

A

1672-5301（2016）11-0985-05

2016-04-21）