藜麦提取物体外抗氧化活性研究

相启森，张丽华，姜亭亭，张文杰，李银丽，申瑞玲，*（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002；2.河南省食品生产与安全协同创新中心，河南郑州450002）

藜麦提取物体外抗氧化活性研究

相启森1，2，张丽华1，2，姜亭亭1，2，张文杰1，2，李银丽1，2，申瑞玲1，2，*
（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002；2.河南省食品生产与安全协同创新中心，河南郑州450002）

以产自山西的藜麦为研究对象，以对DPPH·和ABTS+·的清除能力、铁还原力等为指标，评价了其提取物的体外抗氧化活性。结果表明，藜麦提取物对DPPH·和ABTS+·均有较强的清除能力，其IC50分别为（43.13±2.41）mg/mL和（27.91±1.46）mg/mL；FRAP法测得藜麦抗氧化能力为（1.90±0.10）mg FeSO4/g；此外，藜麦提取物能够有效抑制自由基引发的亚油酸过氧化和牛血清白蛋白氧化降解。藜麦提取物具有较强的体外抗氧化活性，为其体内抗氧化活性的研究奠定了基础。

藜麦，抗氧化活性，自由基清除能力，铁还原能力

藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）又名昆诺阿藜、南美藜等，是一种原产于南美洲安第斯山地区的一年生藜科草本植物，已有5000多年的种植历史［1-2］。藜麦含有丰富的蛋白质、脂肪、矿质元素等营养素并富含植物化学物质，具有很高的食用价值，被古印加人称为“粮食之母”［3］。联合国粮农组织（FAO）认为藜麦是唯一的单一植物即可基满足人体基本营养需求的食物。鉴于藜麦具有很高的营养价值，联合国大会将2013年定为“国际藜麦年”，旨在让世界关注藜麦的生物多样性和营养价值。目前，藜麦已引起了各类生产者、研究机构和普通消费者广泛的关注。我国从1987年开始藜麦的引进种植研究工作，目前藜麦的种植主要集中在山西、甘肃、青海、河北、河南等省［4-5］。目前，国内对藜麦的研究主要集中于优良品种选育、栽培技术优化等方面，而对藜麦生理功能评价、活性成分分离鉴定、保健食品开发等方面的研究报道相对较少［4-6］。

大量研究证实，由机体内自由基过量产生引发的氧化应激是导致神经退行性疾病、肿瘤、心血管疾病、慢性炎症等疾病和衰老的重要原因［7-8］。临床研究证实，适当补充外源性抗氧化剂可改善机体内的氧化应激。膳食中摄入较多的蔬菜、水果、全谷物、豆类等能够有效地预防和减缓上述疾病的发生，这与其富含的多酚类、黄酮类等抗氧化剂密切相关［9］。本研究以产自山西的白色藜麦为对象，研究了其乙醇提取物的体外自由基清除能力、铁离子还原能力及对自由基引发脂质过氧化和蛋白质氧化降解的抑制作用，以期为更好地开发和利用藜麦资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藜麦 山西稼祺农业科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、亚油酸、菲洛嗪（Ferrozine）、牛血清白蛋白（BSA） 合肥博美生物有限公司；2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（AAPH） 阿拉丁试剂（上海）有限公司；β-巯基乙醇、十二烷基磺酸钠（SDS）、丙烯酰胺、N，N'-亚甲双丙烯酰胺、甘氨酸、N，N，N'，N'-四甲基二乙胺（TEMED）、异丙醇、Tris碱、溴酚蓝、过硫酸铵 美国Amresco公司；FeSO4·7H2O、冰乙酸、维生素C（VitC） 天津市化学试剂六厂。

XQ200型多功能高速粉碎机 上海广沙工贸有限公司；UV 8100型紫外分光光度计 北京莱伯泰科仪器有限公司；DZKW型电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂；RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；Mini-Protean Tetra小型垂直电泳槽、PowerPacTM通用电泳仪电源和ChemiDocTMXRS化学发光成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 藜麦提取物的制备 将藜麦粉碎后过60目筛，即为藜麦粉。准确称取5.0 g藜麦全粉，加入100 mL 80%的乙醇溶液，混匀后于室温提取2 h，过滤得上清液，滤渣按上述方法重复提取一次，合并滤液，于45℃水浴下蒸发至干，用80%乙醇定容至12.5 mL，得浓度为400 mg/mL的藜麦提取物，于4℃保存备用［10］。

1.2.2 DPPH·清除能力的测定 用80%乙醇将藜麦提取物稀释成系列浓度溶液，待测。参考文献［11］的方法，取1.0 mL稀释后的藜麦提取液，加入4.0 mL DPPH·甲醇溶液（100 μmol/L），混合均匀后避光静置30 min，测定517 nm处的吸光值并计算DPPH·清除率。以样品浓度为自变量，自由基清除率为因变量作图并进行线性拟合，计算IC50值。同时，以Trolox梯度溶液（0～160 μmol/L）做标准曲线，样品的DPPH·清除能力表示为1 g藜麦样品中所含Trolox当量（μmol Trolox当量/g）。

1.2.3 ABTS+·清除能力的测定 参考文献［12］的方法，将15 mL ABTS溶液（7 mmol/L）与264 μL过硫酸钾溶液（140 mmol/L）混合，在室温下避光下反应16 h后加甲醇进行稀释，使其在734 nm处的吸光度为0.70±0.02。取1.0 mL稀释后的藜麦提取液，加入4.0 mL ABTS+·储备液，充分混匀后室温避光反应30 min，测定734 nm处吸光度并计算清除率。

式中：A0为空白组吸光度，A1为藜麦提取液处理组的吸光度，A0为样液本底的吸光度。

1.2.4 铁还原能力（FRAP）测定 参考文献［13］的方法，分别配制醋酸钠缓冲液（300 mmol/L，pH3.6）、TPTZ溶液（10 mmol/L）和FeCl3·6H2O溶液（20 mmol/L），将上述3种溶液按10∶1∶1比例混合即得FRAP工作液。取4.0 mL FRAP工作液，加入1.0 mL藜麦提取物溶液，混匀后于37℃避光反应30 min，测定593 nm处吸光度。以FeSO4为标准，样品的FRAP值表示为1 g藜麦达到同样吸光度所需FeSO4的微摩尔数表示。

1.2.5 藜麦提取物对Fe2+/VitC诱导亚油酸脂质过氧化的影响 参考Kawai等［14］的方法，采用Fe2+/VitC模型诱导亚油酸发生过氧化反应。在终浓度为1 mmol/L的亚油酸溶液中，先加入藜麦提取物溶液（终浓度分别为30、40、50 mg/mL），再加入FeSO4（终浓度为50 μmol/L）和VitC（终浓度为1 mmol/L），混匀后于37℃水浴避光反应24 h。反应结束后，测定硫代巴比妥酸反应产物（TBARS）含量［15］。

1.2.6 藜麦提取物对AAPH诱导蛋白氧化降解的影响 在BSA终浓度为0.5 mg/mL的反应体系中，加入藜麦提取物和终浓度为100 mmol/L的AAPH溶液，于37℃水浴反应6 h。反应结束后，取100 μL反应液转移至1.5 mL离心管中，加入电泳上样缓冲液并在100℃加热煮沸5 min，采用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，用考马斯蓝R-250染色30 min，脱色液脱色，使用Chemi DocTMXRS化学发光成像系统进行凝胶成像［16］。

1.3 数据统计分析

所有实验处理重复3次，实验结果均表示为平均值±标准差。采用SPSS for Windows 19.0软件进行数据处理，各组间的差异比较采用独立样本t检验，p＜0.05表示差异显著，p＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 藜麦提取物对DPPH·的清除作用

图1 藜麦提取物对DPPH·的清除作用Fig.1 DPPH·radical scavenging activity of quinoa extract

DPPH·清除实验是一种简单、快速、灵敏的抗氧化检测手段，广泛应用于天然植物提取物体外抗氧化能力检测。如图1所示，藜麦提取物能够有效清除DPPH·，且清除率随添加浓度的增加而升高，呈良好的剂量-效应关系。对藜麦提取物浓度（0～50 mg/mL）和DPPH·清除率进行线性拟合，求得藜麦提取物清除DPPH·的IC50值为（43.13±2.41）mg/mL。以Trolox为对照品绘制标准曲线，求得回归方程为y=0.435x-0.458，R2=0.998，其中y为DPPH·的清除率，x为Trolox溶液浓度（μmol/L）。经计算，藜麦提取物清除DPPH· 的Trolox当量为（0.81±0.05）mg/g。

2.2 藜麦提取物对ABTS+·的清除作用

由图2可知，藜麦提取物对ABTS+·具有较强的清除效果，且清除能力随其添加浓度的升高而越强，呈良好的剂量-效应关系（图2）。对ABTS+·清除率和藜麦提取物浓度（0～40 mg/mL）进行线性拟合，求得藜麦提取物清除ABTS+·的IC50值为（27.91±1.46）mg/mL。

图2 藜麦提取物对ABTS+·的清除作用Fig.2 ABTS+·radical scavenging capacity of quinoa extract

2.3 藜麦提取物的铁还原能力（FRAP）

在一般情况下，物质的还原能力与抗氧化能力呈正相关，因此可通过待测物将TPTZ-Fe3+还原成TPTZ-Fe2+的能力来反映其抗氧化能力，结果常表示为Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力［17］。由图3可知，在0～40 mg/mL浓度范围内，随着藜麦提取物浓度的增加，反应液在593 nm吸光度逐渐升高，即铁离子还原能力逐渐升高。以FeSO4为标准物质绘制标准曲线，求得回归方程为y=0.002x+0.014，R2=0.997，其中y 为FeSO4标准溶液在593 nm处的吸光度，x为FeSO4标准溶液浓度（μmol/L）。经计算，藜麦的FeSO4当量为（1.90±0.10）mg/g。

图3 藜麦提取物的铁离子还原能力Fig.3 Ferric reducing antioxidant power of quinoa extract

2.4 藜麦提取物对Fe2+/VitC诱导亚油酸氧化的抑制作用

亚油酸是一种含有两个双键的ω-6脂肪酸，极易发生氧化。不同浓度藜麦提取物对Fe2+/VitC诱导亚油酸脂质过氧化过程中TBARS生成的影响见图4。

由图4可知，亚油酸在无Fe2+/VitC条件下氧化反应较为缓慢，所形成TBARS含量较低（6.11±1.25）μmol/L；亚油酸与Fe2+/VitC在37℃条件下反应24 h后，TBARS含量升高至（27.49±2.08）μmol/L，与空白对照组相比极显著增加（p＜0.01）。在上述反应体系中加入终浓度分别为40 mg/mL和50 mg/mL的藜麦提取物可以显著抑制亚油酸脂质过氧化过程中TBARS的生成（p＜0.01）。

图4 藜麦提取物对Fe2+/VitC诱导亚油酸氧化的抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of quinoa extract on Fe2+/VitC-mediated linoleic acid oxidation

2.5 藜麦提取物对APPH诱导蛋白氧化降解的抑制作用

蛋白质是自由基攻击的重要目标，自由基引发的蛋白质损伤参与了多种疾病的发生［18］。AAPH是一种偶氮类化合物，在热分解过程中产量的大量自由基能够攻击BSA蛋白，使其多肽链发生断裂并生成小分子量的肽链；经考马斯蓝R-250染色后，原始蛋白条带信号减弱。藜麦提取物对AAPH诱导BSA蛋白氧化降解的影响见图5。

图5 藜麦提取物对AAPH诱导BSA蛋白氧化降解的影响Fig.5 Effect of quinoa extract on AAPH-induced BSA oxidative degradation

如图5所示，与100 mmol/L AAPH在37℃水浴反应6 h后，BSA蛋白在自由基作用下发生氧化降解，造成其蛋白条带颜色变浅。与AAPH单独处理组相比，浓度分别为10、50 μg/mL和100 μg/mL的藜麦提取物处理组蛋白条带颜色逐渐加深，表明藜麦提取物能够有效抑制AAPH诱导的BSA氧化降解，且抑制作用随添加浓度的升高而增强。

3 结论

藜麦乙醇提取物具有良好的体外抗氧化活性，能有效清除DPPH·和ABTS+·，还原能力较强，并能够有效抑制自由基引发的亚油酸过氧化和牛血清白蛋白氧化降解；在实验质量浓度范围内，藜麦乙醇提取物的抗氧化能力随其添加浓度的增加而增强，呈现良好的剂量-效应关系。藜麦作为最适宜人类的全营养食品，应当进一步分离和鉴定其抗氧化活性成分，确定藜麦抗氧化作用的物质基础；还应进一步深入探讨藜麦体内抗氧化作用及抗氧化机理，从而为藜麦资源的深层次综合开发利用提供科学理论依据。

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Determination of the in vitro antioxidant capacity of quinoa seeds extracts

XIANG Qi-sen1，2，ZHANG Li-hua1，2，JIANG Ting-ting1，2，ZHANG Wen-jie1，2，LI Yin-li1，2，SHEN Rui-ling1，2，*
（1.College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China；2.Henan Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety，Zhengzhou 450002，China）

The aim of this study was to investigate the in vitro antioxidant activities of extract from quinoa seeds collected from Shanxi using various methods，including DPPH·and ABTS+·scavenging assays and ferric reducing antioxidant power（FRAP）assay.The results showed that the quinoa extract had strong scavenging activities for DPPH·and ABTS+·radicals.The radical scavenging IC50values of quinoa extract were（43.13± 2.41）mg/mL and（27.91±1.46）mg/mL for DPPH·and ABTS+·radicals，respectively.The FRAP value of quinoa was（1.90±0.10）mg FeSO4/g.The quinoa extract also significantly inhibited free radical-induced peroxidation of linoleic acid and oxidative degradation of bovine serum albumin.The present study demonstrated the in vitro antioxidant potential of quinoa seeds extracts，providing scientific basis for the estimation of the in vivo antioxidant activities of quinoa seeds.

quinoa seeds；antioxidant capacity；free radical scavenging capacity；ferric reducing antioxidant power

TS202.1

A

1002-0306（2016）02-0078-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.007

2015－06－12

相启森（1984-），博士，讲师，研究方向：食品化学与营养，E-mail：xiangqisen2006@163.com。

*通讯作者：申瑞玲（1967-），博士，教授，研究方向：食品化学与营养，E-mail：shenrl1967@163.com。

河南省高等学校重点科研项目（15A550024）；郑州轻工业学院博士科研基金资助项目（2013BSJJ079）。